Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Bovine tunica albuginea conserved in honey as xenograft for cystoplasty in rats / Túnica albugínea bovina conservada em mel como xenoenxerto na cistoplastia em ratos

Urinary bladder damages leading to few viable bladder tissue available might demand a challenging reconstructive surgery. In this context, biomaterials are valid alternatives for bladder reconstruction. This study evaluated the bovine tunica albuginea fragment as graft material for cystoplasty in rats and honey-preserved implant viability. Thirty Wistar rats were assigned to two groups: (1) a test group (T) with a circular 1.0-cm-diameterbovine tunica albuginea graft application in the apex region by a continuous absorbable (Polyglactin 910 5-0) suture with stitching of all bladder layers and (2) a simulation group (S) in which animals underwent only partial cystectomy. In addition, each of these groups was further divided into three subgroups according to euthanasia period on post-surgery day 7, 15 and 30. Two animals had self-limiting hematuria at postsurgical period. At necropsy, frequent crystals and adhesion to the peritoneum were observed. At the histopathological evaluation, animals from the T group euthanized by 15th postoperative day had layers disorganization and initial muscle development, while T group rats euthanized by 30th postoperative day showed complete urothelization. Urothelization pattern was similar in both groups. Moreover, the muscular layer formation was present in both groups, but more evident in S group animals. Nevertheless, inflammatory infiltrate and neovascularization were remarkably more intense in T group rats. It might be concluded that bovine tunica albuginea graft was successful in repairing rats bladder, being a good biomaterial option in reconstructive urinary vesicle surgery.(AU)

Lesões na vesícula urinária que culminem em pouco tecido vesical viável podem demandar cirurgias reconstrutivas desafiadoras. Neste contexto, biomateriais são alternativas válidas para a reconstrução da bexiga. O objetivo deste trabalho foi avaliar a túnica albugínea bovina como material para enxerto na cistoplastia em ratos, assim como a viabilidade deste implante preservado em mel. Trinta ratos Wistar foram divididos em dois grupos: (1) um grupo teste (T), no qual os animais foram submetidos a cistectomia parcial seguida de cistoplastia com aplicação do enxerto circular com 1,0cm de diâmetro de túnica albugínea bovina na região do ápice com sutura absorvível (Poliglactina 910 5-0) em padrão contínuo englobando todas as camadas da bexiga; e (2) um grupo simulação (S), cujos ratos realizaram apenas cistectomia parcial. Além disso, cada grupo foi posteriormente dividido em três subgrupos de acordo com a data de eutanásia no dia 7, 15 ou 30 de pós-operatório. Dois animais apresentaram hematúria autolimitante no período de observação pós-operatória. Na necrópsia, notaram-se cristais frequentes e aderências entre bexiga e peritônio. Na avaliação histopatológica, animais do grupo T eutanasiados com 15 dias de pós-operatório apresentavam camadas vesicais desorganizadas e formação de musculatura inicial na bexiga, enquanto aqueles eutanasiados com 30 dias de cirurgia mostraram urotelização completa. O padrão de urotelização foi semelhante nos dois grupos. Além disso, a formação da camada muscular esteve presente em ambos os grupos, porém mais evidente nos animais do grupo S. No entanto, o infiltrado inflamatório bem como a neovascularização foram notavelmente mais intensos nos ratos do grupo T. Pode-se concluir que o enxerto de túnica albugínea bovina foi bem sucedido no reparo da vesícula urinária de ratos, demonstrando ser uma boa opção de biomaterial para cirurgias reconstrutivas da vesícula urinária.(AU)

Techniques of orthotopic renal transplantation. II. Size-matched porcine grafts in monkey recipients

ABSTRACT Purpose As a classical xenotransplantation model, porcine kidneys have been transplanted into the lower abdomen of non-human primates. However, we have improved upon this model by using size-matched grafting in the orthotopic position. The beneficial aspects and surgical details of our method are reported herein. Methods Donors were two newborn pigs (weighting 5 to 6 kg) and recipients were two cynomolgus monkeys (weighting, approximately, 7 kg). After bilateral nephrectomy, kidneys were cold-transported in Euro-Collins solution. The porcine kidney was transplanted to the site of a left nephrectomy and fixed to the peritoneum. Results Kidneys transplanted to the lower abdomen by the conventional method were more susceptible to torsion of the renal vein (two cases). In contrast, early-stage blood flow insufficiency did not occur in orthotopic transplants of theleft kidney. Conclusions Size-matched porcine-primate renal grafting using our method of transplanting tothe natural position of the kidneys contributes to stable post-transplant blood flow to the kidney.

Rescue of caprine fetal ovaries, vitrification and follicular development after xenotransplantation in two immunodeficient mice models

Domestic and wild goats are very susceptible animals to predation, specially when pregnancy occurs. This study aimed to evaluate the use of goat fetal ovarian tissue for vitrification followed by xenotransplantation and fresh xenotransplantation in two immunosuppressed mice models (C57BL/6 SCID and Balb-C NUDE). Goat fetus ovaries were collected in slaughterhouses, divided into small cortical pieces and were destined for fresh xenotransplantation (FX) and cryopreservation followed by xenotransplantation (CX). Five recipients from each lineage were used for FX and 10 animals from each lineage for CX. The mice were euthanized after 65 postoperative days, and the transplants were collected for microscopic assessment. The blood plasma was collected for estradiol measurement. Independently of mice strain, all recipients presented complete estrus cycle in FX and 80% after CX groups. Follicles were observed at all development stages without morphological changes. The volume density and total vessel surface observed in the transplants were different (p <0.01) between groups. The estradiol levels in the recipients did not differ (p <0.05) among the treatments. Thus, it is possible to activate the preantral follicles in the ovaries of fetuses by optimizing germplasm utilization and conservation of domestic and endangered wild goats that are in predatory situations, undesirable drowning or accidental death, since provided conditions for xenotransplantation are performed.

Rescue of caprine fetal ovaries, vitrification and follicular development after xenotransplantation in two immunodeficient mice models

Domestic and wild goats are very susceptible animals to predation, specially when pregnancy occurs. This study aimed to evaluate the use of goat fetal ovarian tissue for vitrification followed by xenotransplantation and fresh xenotransplantation in two immunosuppressed mice models (C57BL/6 SCID and Balb-C NUDE). Goat fetus ovaries were collected in slaughterhouses, divided into small cortical pieces and were destined for fresh xenotransplantation (FX) and cryopreservation followed by xenotransplantation (CX). Five recipients from each lineage were used for FX and 10 animals from each lineage for CX. The mice were euthanized after 65 postoperative days, and the transplants were collected for microscopic assessment. The blood plasma was collected for estradiol measurement. Independently of mice strain, all recipients presented complete estrus cycle in FX and 80% after CX groups. Follicles were observed at all development stages without morphological changes. The volume density and total vessel surface observed in the transplants were different (p <0.01) between groups. The estradiol levels in the recipients did not differ (p <0.05) among the treatments. Thus, it is possible to activate the preantral follicles in the ovaries of fetuses by optimizing germplasm utilization and conservation of domestic and endangered wild goats that are in predatory situations, undesirable drowning or accidental death, since provided conditions for xenotransplantation are performed.(AU)

A decade of experience with genetically tailored pig models for diabetes and metabolic research

Abstract The global prevalence of diabetes mellitus and other metabolic diseases is rapidly increasing. Animal models play pivotal roles in unravelling disease mechanisms and developing and testing therapeutic strategies. Rodents are the most widely used animal models but may have limitations in their resemblance to human disease mechanisms and phenotypes. Findings in rodent models are consequently often difficult to extrapolate to human clinical trials. To overcome this translational gap, we and other groups are developing porcine disease models. Pigs share many anatomical and physiological traits with humans and thus hold great promise as translational animal models. Importantly, the toolbox for genetic engineering of pigs is rapidly expanding. Human disease mechanisms and targets can therefore be reproduced in pigs on a molecular level, resulting in precise and predictive porcine (PPP) models. In this short review, we summarize our work on the development of genetically (pre)diabetic pig models and how they have been used to study disease mechanisms and test therapeutic strategies. This includes the generation of reporter pigs for studying beta-cell maturation and physiology. Furthermore, genetically engineered pigs are promising donors of pancreatic islets for xenotransplantation. In summary, genetically tailored pig models have become an important link in the chain of translational diabetes and metabolic research.

A decade of experience with genetically tailored pig models for diabetes and metabolic research

Abstract The global prevalence of diabetes mellitus and other metabolic diseases is rapidly increasing. Animal models play pivotal roles in unravelling disease mechanisms and developing and testing therapeutic strategies. Rodents are the most widely used animal models but may have limitations in their resemblance to human disease mechanisms and phenotypes. Findings in rodent models are consequently often difficult to extrapolate to human clinical trials. To overcome this translational gap, we and other groups are developing porcine disease models. Pigs share many anatomical and physiological traits with humans and thus hold great promise as translational animal models. Importantly, the toolbox for genetic engineering of pigs is rapidly expanding. Human disease mechanisms and targets can therefore be reproduced in pigs on a molecular level, resulting in precise and predictive porcine (PPP) models. In this short review, we summarize our work on the development of genetically (pre)diabetic pig models and how they have been used to study disease mechanisms and test therapeutic strategies. This includes the generation of reporter pigs for studying beta-cell maturation and physiology. Furthermore, genetically engineered pigs are promising donors of pancreatic islets for xenotransplantation. In summary, genetically tailored pig models have become an important link in the chain of translational diabetes and metabolic research.

Impact of ovarian fetal tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production in annual genetic gain estimates for cattle weight traits / Impacto do xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões em estimativas de ganho genético anual para características de peso em bovinos

The present paper aims to estimate the impact of the reduction of the generation interval, based on the model of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production to estimate the annual genetic gain of weight traits in a bovine herd. Weigh data and genealogy of Brahman animals were used to estimate the annual direct genetic gain for weight at birth, weight at 120 days, at 210 days, and at 550 days of age. The genetic parameters were obtained by animal model, via Bayesian inference, by Markov Chain Monte Carlo (MCMC) methods. For the estimates, different generation intervals were defined as the average value between the supposed maternal generation intervals and the average sire generation interval based on the analyzed data (9.6 years). The shortest generation interval considered was 5.1 years, outlined from the average of 0.66 year (corresponds to 8 fetal months, an assumption defined based on the use of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production) and 9.6 years (sire generation interval). The remaining intervals considered were 6.7, 8.7 and 10.2 years. The estimate of annual direct genetic gain for all the evaluated traits was higher when considering the generation interval outlined based on the model of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production. The estimates were lower as the generation interval increased. The use of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production, may favor the reduction of the generation interval and successively generate a positive impact on the annual direct genetic gain estimates.

O presente estudo teve como objetivo estimar o impacto da redução do intervalo de gerações, com base no modelo de xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões, na estimativa do ganho genético anual direto de características de peso em um rebanho bovino. Dados de pesagens e genealogia de animais da raça Brahman foram utilizados para estimar o ganho genético direto anual para as características peso ao nascimento, peso aos 120 dias, aos 210 dias e aos 550 dias de idade. Os parâmetros genéticos foram obtidos por modelo animal, via inferência Bayesiana, por Métodos de Monte Carlo via Cadeias de Markov. Para as estimativas, foram delineados intervalos de gerações distintos, definidos como a média entre os supostos intervalos de gerações materno e o intervalo de gerações paterno médio do rebanho analisado (9,6 anos). O menor intervalo de gerações considerado foi 5,1 anos, resultante da média entre 0,66 ano (corresponde a 8 meses fetais, suposição definida com base na utilização da biotecnologia xenotransplante de tecido ovariano fetal associada à produção in vitro de embriões) e 9,6 anos. Os demais intervalos considerados foram 6,7, 8,7 e 10,2 anos. A estimativa do ganho genético anual para todas as características avaliadas foi superior quando se considerou o intervalo de gerações delineado com base no modelo de xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões. As estimativas foram menores conforme aumento no intervalo de gerações. O uso da biotecnologia xenotransplante de tecido ovariano fetal, associada à produção in vitro de embriões poderá favorecer a redução do intervalo de gerações e sucessivamente gerar impacto positivo nas estimativas de ganho genético direto anual.

Impact of ovarian fetal tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production in annual genetic gain estimates for cattle weight traits / Impacto do xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões em estimativas de ganho genético anual para características de peso em bovinos

The present paper aims to estimate the impact of the reduction of the generation interval, based on the model of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production to estimate the annual genetic gain of weight traits in a bovine herd. Weigh data and genealogy of Brahman animals were used to estimate the annual direct genetic gain for weight at birth, weight at 120 days, at 210 days, and at 550 days of age. The genetic parameters were obtained by animal model, via Bayesian inference, by Markov Chain Monte Carlo (MCMC) methods. For the estimates, different generation intervals were defined as the average value between the supposed maternal generation intervals and the average sire generation interval based on the analyzed data (9.6 years). The shortest generation interval considered was 5.1 years, outlined from the average of 0.66 year (corresponds to 8 fetal months, an assumption defined based on the use of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production) and 9.6 years (sire generation interval). The remaining intervals considered were 6.7, 8.7 and 10.2 years. The estimate of annual direct genetic gain for all the evaluated traits was higher when considering the generation interval outlined based on the model of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production. The estimates were lower as the generation interval increased. The use of fetal ovarian tissue xenotransplantation associated with in vitro embryo production, may favor the reduction of the generation interval and successively generate a positive impact on the annual direct genetic gain estimates.(AU)

O presente estudo teve como objetivo estimar o impacto da redução do intervalo de gerações, com base no modelo de xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões, na estimativa do ganho genético anual direto de características de peso em um rebanho bovino. Dados de pesagens e genealogia de animais da raça Brahman foram utilizados para estimar o ganho genético direto anual para as características peso ao nascimento, peso aos 120 dias, aos 210 dias e aos 550 dias de idade. Os parâmetros genéticos foram obtidos por modelo animal, via inferência Bayesiana, por Métodos de Monte Carlo via Cadeias de Markov. Para as estimativas, foram delineados intervalos de gerações distintos, definidos como a média entre os supostos intervalos de gerações materno e o intervalo de gerações paterno médio do rebanho analisado (9,6 anos). O menor intervalo de gerações considerado foi 5,1 anos, resultante da média entre 0,66 ano (corresponde a 8 meses fetais, suposição definida com base na utilização da biotecnologia xenotransplante de tecido ovariano fetal associada à produção in vitro de embriões) e 9,6 anos. Os demais intervalos considerados foram 6,7, 8,7 e 10,2 anos. A estimativa do ganho genético anual para todas as características avaliadas foi superior quando se considerou o intervalo de gerações delineado com base no modelo de xenotransplante de tecido ovariano fetal associado à produção in vitro de embriões. As estimativas foram menores conforme aumento no intervalo de gerações. O uso da biotecnologia xenotransplante de tecido ovariano fetal, associada à produção in vitro de embriões poderá favorecer a redução do intervalo de gerações e sucessivamente gerar impacto positivo nas estimativas de ganho genético direto anual.(AU)

Successful xenotransfusion from a domestic dog (Canis familiaris) to an Andean fox (Lycalopex culpaeus) / Sucesso da xenotransfusão de um cão doméstico (Canis familiaris) para uma raposa andina (Lycalopex culpaeus)

An Andean fox was transferred to the Wildlife Hospital of the Universidad San Francisco de Quito for evaluation of injuries caused by a run over. Clinical signs of hypovolemic shock were detected. Radiographies showed multiple pelvic fractures and free fluid in retroperitoneal cavity. The presumptive diagnosis was hemorrhagic shock caused by blood loss secondary to a pelvis fracture. An emergency xenotransfusion using blood from a domestic dog was performed without acute transfusion reactions observed. This is the first report of successful xenotransfusion between a domestic dog and an Andean fox presenting a procedure that could be applied in emergency situations.(AU)

Uma raposa andina foi levada ao Hospital da Vida Selvagem da Universidad San Francisco de Quito para avaliar os ferimentos causados por um atropelamento. Sinais clínicos de choque hipovolêmico foram detectados. Radiografias mostraram múltiplas fraturas pélvicas e fluido livre na cavidade retroperitoneal. O diagnóstico presuntivo foi um choque hemorrágico causado por perda sanguínea secundária a uma fratura pélvica. Uma xenotransfusão de emergência foi realizada com o sangue de um cão doméstico sem reações agudas transfusionais. Este é o primeiro relato bem sucedido de xenotransfusão entre um cão doméstico e uma raposa andina, demonstrando que é um procedimento que poderá ser considerado em situações de emergência.(AU)

Successful xenotransfusion from a domestic dog (Canis familiaris) to an Andean fox (Lycalopex culpaeus) / Sucesso da xenotransfusão de um cão doméstico (Canis familiaris) para uma raposa andina (Lycalopex culpaeus)

An Andean fox was transferred to the Wildlife Hospital of the Universidad San Francisco de Quito for evaluation of injuries caused by a run over. Clinical signs of hypovolemic shock were detected. Radiographies showed multiple pelvic fractures and free fluid in retroperitoneal cavity. The presumptive diagnosis was hemorrhagic shock caused by blood loss secondary to a pelvis fracture. An emergency xenotransfusion using blood from a domestic dog was performed without acute transfusion reactions observed. This is the first report of successful xenotransfusion between a domestic dog and an Andean fox presenting a procedure that could be applied in emergency situations.(AU)

Uma raposa andina foi levada ao Hospital da Vida Selvagem da Universidad San Francisco de Quito para avaliar os ferimentos causados por um atropelamento. Sinais clínicos de choque hipovolêmico foram detectados. Radiografias mostraram múltiplas fraturas pélvicas e fluido livre na cavidade retroperitoneal. O diagnóstico presuntivo foi um choque hemorrágico causado por perda sanguínea secundária a uma fratura pélvica. Uma xenotransfusão de emergência foi realizada com o sangue de um cão doméstico sem reações agudas transfusionais. Este é o primeiro relato bem sucedido de xenotransfusão entre um cão doméstico e uma raposa andina, demonstrando que é um procedimento que poderá ser considerado em situações de emergência.(AU)

Xenogeneic mesenchymal stem cells in the formation of hyaline cartilage in osteochondral goat failure

Background: Osteochondral knee failures are among the most common causes of disability among the elderly human population and animal athletes. The xenogeneic transplantation of mesenchymal stem cells is a questionable therapeutic alternative that, despite the low expression of Major Histocompatibility Complex type II by these cells, still has relevant uncertainties about the safety and clinical efficacy. The main objective of the present study was to investigate whether the xenogeneic transplantation of mesenchymal stem cells induces hyaline cartilage formation, without histopathological evidence of rejection, in osteochondral failures of goats.Materials, Methods & Results: Five female goats were used, submitted to three surgical osteocondral failures in the right knee, treated with xenogenic mesenchymal stem cells of dental pulp, xenogenic platelet-rich plasma and hemostatic sponge of hydrolyzed collagen, respectively. The lesions were evaluated after 60 days of treatment, aiming to identify the presence of hyaline cartilage or fibrocartilage and the subchondral bone pattern (regenerated or disorganized). Transplantation of xenogenic mesenchymal stem cells induced predominant formation of hyaline cartilage (P 0.05). Macroscopically, the lesions of the stem cell treated group showed formation of firm repair tissue, opaque staining, integrated with adjacent cartilage and with the failure filling almost completely. The groups treated with PRP and hemostatic sponge of hydrolyzed collagen presented, on average, partial filling of the lesion, with irregular shape and darkened coloration.[...]

Xenogeneic mesenchymal stem cells in the formation of hyaline cartilage in osteochondral goat failure

Background: Osteochondral knee failures are among the most common causes of disability among the elderly human population and animal athletes. The xenogeneic transplantation of mesenchymal stem cells is a questionable therapeutic alternative that, despite the low expression of Major Histocompatibility Complex type II by these cells, still has relevant uncertainties about the safety and clinical efficacy. The main objective of the present study was to investigate whether the xenogeneic transplantation of mesenchymal stem cells induces hyaline cartilage formation, without histopathological evidence of rejection, in osteochondral failures of goats.Materials, Methods & Results: Five female goats were used, submitted to three surgical osteocondral failures in the right knee, treated with xenogenic mesenchymal stem cells of dental pulp, xenogenic platelet-rich plasma and hemostatic sponge of hydrolyzed collagen, respectively. The lesions were evaluated after 60 days of treatment, aiming to identify the presence of hyaline cartilage or fibrocartilage and the subchondral bone pattern (regenerated or disorganized). Transplantation of xenogenic mesenchymal stem cells induced predominant formation of hyaline cartilage (P < 0.05), with no histopathological evidence of inflammation when compared to the other treatments. Therapies with xenogeneic platelet-rich plasma and hemostatic sponge of hydrolyzed collagen induced greater formation of fibrocartilaginous cartilage, with no significant difference between them (P > 0.05). Macroscopically, the lesions of the stem cell treated group showed formation of firm repair tissue, opaque staining, integrated with adjacent cartilage and with the failure filling almost completely. The groups treated with PRP and hemostatic sponge of hydrolyzed collagen presented, on average, partial filling of the lesion, with irregular shape and darkened coloration.[...](AU)

Biochemical, thermographic, and follicular responses of murine models of hormone-treated bovine ovarian renal capsule xenografts / Respostas bioquímicas, termográficas e foliculares de modelos murinos tratados hormonalmente após xenotransplante de ovário bovino sob a cápsula renal

This study aimed to evaluate the characteristics of two different murine models of hormone-treated renal-encapsulated bovine ovarian tissue xenotransplantation. Two immunodeficient mouse models (BALB/c Nude and C57BL6 SCID) were xenografted with ovarian pieces from heifers and each group was subjected to two hormonal treatments of eCG or a combination of FSH+LH. Donor ovaries and recipients were evaluated by histology and infrared thermography at different times. At the time of xenograft collection, animals were evaluated for alterations in hepatorenal biochemistry. The statistical test used in the study was ANOVA, followed by Tukey's test. Among the strains, 80% of C57BL6 SCID and 77% of BALB/c Nude mice showed development and vascularization of the transplanted tissue, which acquired cyclicity at 19 and 9 days post-transplant, respectively. Hemorrhagic follicles in xenografts induced with FSH+LH were found in the C57BL6 SCID strain. Infrared thermography was insufficient to distinguish the tissue donor recipient. In conclusion, the C57BL6 SCID strain appears to be the best host for ovarian xenografts, since the transplants in these mice were viable and showed robust follicular development. This work will aid future choices of immunodeficient strains for xenografting procedures.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar as características dos dois diferentes modelos de murinas tratadas hormonalmente após xenotransplante de tecido ovariano bovino sob a cápsula renal. Dois modelos de camundongos imunodeficientes (BALB/c NUDE e C57BL6 SCID) receberam fragmentos de ovário de novilhas e cada grupo foi submetido a dois tratamentos hormonais de eCG ou uma combinação de FSH+LH. Ovários doadores e receptores foram avaliados por histologia e termografia infravermelha em diferentes momentos. No momento da retirada do xenotranplante, os animais foram avaliados quanto a alterações na bioquímica hepatorrenal. O teste estatístico utilizado no estudo foi ANOVA, seguido do teste de Tukey. Entre as linhagens, 80% de C57BL6 SCID e 77% das BALB/c NUDE mostraram desenvolvimento e vascularização do tecido transplantado, que adquiriu a ciclicidade 19 e 9 dias após o transplante, respectivamente. Corpos hemorrágicos foram encontrados após o xenotransplante induzidos com FSH+LH na linhagem C57BL6 SCID. A termografia infravermelha foi insuficiente para distinguir o tecido doador do receptor. Em conclusão, a linhagem C57BL6 SCID demonstrou ser o melhor hospedeiro para xenotransplante de ovário, uma vez que os transplantes nestes camundongos foram viáveis e mostraram desenvolvimento folicular. Este trabalho ajudará futuras escolhas de linhagens imunodeficientes para procedimentos de xenotranplante.(AU)

Biochemical, thermographic, and follicular responses of murine models of hormone-treated bovine ovarian renal capsule xenografts / Respostas bioquímicas, termográficas e foliculares de modelos murinos tratados hormonalmente após xenotransplante de ovário bovino sob a cápsula renal

This study aimed to evaluate the characteristics of two different murine models of hormone-treated renal-encapsulated bovine ovarian tissue xenotransplantation. Two immunodeficient mouse models (BALB/c Nude and C57BL6 SCID) were xenografted with ovarian pieces from heifers and each group was subjected to two hormonal treatments of eCG or a combination of FSH+LH. Donor ovaries and recipients were evaluated by histology and infrared thermography at different times. At the time of xenograft collection, animals were evaluated for alterations in hepatorenal biochemistry. The statistical test used in the study was ANOVA, followed by Tukeys test. Among the strains, 80% of C57BL6 SCID and 77% of BALB/c Nude mice showed development and vascularization of the transplanted tissue, which acquired cyclicity at 19 and 9 days post-transplant, respectively. Hemorrhagic follicles in xenografts induced with FSH+LH were found in the C57BL6 SCID strain. Infrared thermography was insufficient to distinguish the tissue donor recipient. In conclusion, the C57BL6 SCID strain appears to be the best host for ovarian xenografts, since the transplants in these mice were viable and showed robust follicular development. This work will aid future choices of immunodeficient strains for xenografting procedures.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar as características dos dois diferentes modelos de murinas tratadas hormonalmente após xenotransplante de tecido ovariano bovino sob a cápsula renal. Dois modelos de camundongos imunodeficientes (BALB/c NUDE e C57BL6 SCID) receberam fragmentos de ovário de novilhas e cada grupo foi submetido a dois tratamentos hormonais de eCG ou uma combinação de FSH+LH. Ovários doadores e receptores foram avaliados por histologia e termografia infravermelha em diferentes momentos. No momento da retirada do xenotranplante, os animais foram avaliados quanto a alterações na bioquímica hepatorrenal. O teste estatístico utilizado no estudo foi ANOVA, seguido do teste de Tukey. Entre as linhagens, 80% de C57BL6 SCID e 77% das BALB/c NUDE mostraram desenvolvimento e vascularização do tecido transplantado, que adquiriu a ciclicidade 19 e 9 dias após o transplante, respectivamente. Corpos hemorrágicos foram encontrados após o xenotransplante induzidos com FSH+LH na linhagem C57BL6 SCID. A termografia infravermelha foi insuficiente para distinguir o tecido doador do receptor. Em conclusão, a linhagem C57BL6 SCID demonstrou ser o melhor hospedeiro para xenotransplante de ovário, uma vez que os transplantes nestes camundongos foram viáveis e mostraram desenvolvimento folicular. Este trabalho ajudará futuras escolhas de linhagens imunodeficientes para procedimentos de xenotranplante.(AU)

XENOTRANSPLANTE DE FRAGMENTOS DE CÓRTEX OVARIANO BOVINO TRATADOS COM RESVERATROL

O processo de restabelecimento da circulação sanguínea após o transplante, tem influência na sobrevivência do tecido e no desenvolvimento folicular. O resveratrol tem sido utilizado em inúmeros estudos, por apresentar efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. No entanto, não existe informação sobre possíveis ações benéficas do resveratrol nos tecidos ovarianos que serão destinados ao transplante. Objetivou-se, no primeiro experimento, realizar a vitrificação de tecido ovariano com e sem resveratrol, e após o cultivo in vitro e xenotransplante de tecido ovariano de fêmeas bovinas, avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos pré- antrais, e ainda, o estresse oxidativo, os níveis de degeneração celular e a apoptose no tecido, e no segundo experimento, realizar a incubação do tecido ovariano por 24 horas em meio de cultivo acrescido ou não com resveratrol, seguido do cultivo in vivo (xenotransplante) e avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos préantrais. Observou-se que no primeiro experimento, os tecidos que foram vitrificados com resveratrol, apresentaram menores taxas de degeneração celular (p<0,05) quando comparado aos tecidos vitrificados sem resveratrol. O xenotransplante fresco por 7 dias, apresentou viabilidade folicular semelhante ao controle cultivado in vitro por 7 dias. A vitrificação com resveratrol seguida do xenotransplante apresentou maior taxa de degeneração celular e apoptose, do que os tecidos vitrificados sem resveratrol e xenotransplantados. No segundo experimento, o grupo de tecidos ovarianos incubados com resveratrol e xenotransplantados por 14 e 28 dias apresentou menor (P < 0,05) viabilidade e ativação folicular que os tecidos incubados sem adição do antioxidante resveratrol. O grupo xenotransplante fresco e o grupo xenotransplantes incubado sem resveratrol por 14 e 28 dias, apresentaram viabilidade folicular semelhante (P > 0,05) ao grupo controle fresco. Frente aos resultados obtidos, podemos concluir que o uso de resveratrol em soluções de vitrificação reduz a viabilidade folicular de tecidos ovarianos de fêmeas bovinas após xenotransplante por 7 dias. A utilização do cultivo in vivo (xenotransplante) sem resveratrol, demonstrou bons resultados na manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano bovino, levando a manutenção folicular pelo período de 28 dias de transplante.

The process of reestablishing blood circulation after transplantation has an influence on tissue survival and follicular development. Resveratrol has been used in numerous studies, presenting antioxidant and anti-inflammatory effects. However, the possible beneficial actions of resveratrol in the ovarian tissues that will be aimed for transplantation is still not established. The aim of the first study was to vitrify ovarian tissue with resveratrol, and to evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles after in vitro and in vivo cultivation (xenotransplantation) of ovarian tissue of bovine females. We also evaluate oxidative stress, levels of cell degeneration, and apoptosis in the tissue. In the second study we evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles in the ovarian tissue that was incubate for 24 hours in cultivation medium with addition of resveratrol and after in vivo cultivation (xenotransplantation). The tissues that were vitrified with resveratrol, presented lower rates of cell degeneration (p <0.05) when compared to the vitrified tissues without resveratrol. Fresh xenotransplantation for 7 days presented follicular viability similar to the cultured control in vitro for 7 days. Resveratrol vitrification followed by xenotransplantation presented a higher rate of cell degeneration and apoptosis than vitrified tissues without resveratrol and xenotransplantation. The group of ovarian tissues incubated with resveratrol and xenotransplantation for 14 and 28 days presented less viability (P <0.05) and follicular activation than the tissues incubated without the addition of the antioxidant resveratrol. The fresh xenotransplantation and xenotransplantation groups incubated without resveratrol for 14 and 28 days presented similar follicular viability (P> 0.05) to the fresh control group. The use of resveratrol in vitrification solutions reduces the follicular viability of ovarian tissues of bovine females after xenotransplantation for 7 days. The use of in vivo cultivation (xenotransplantation) without resveratrol, demonstrated good results in maintaining the viability of pre-antral follicles included in bovine ovarian tissue, leading to follicular maintenance for the period of 28 days of transplantation.

EFEITO DO RESFRIAMENTO, CRIOPRESERVAÇÃO, E EXPOSIÇÃO AO FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR SOBRE TECIDO OVARIANO EQUINO AUTO OU XENOTRANSPLANTADO

Os objetivos deste estudo foram: 1) Avaliar a eficiência da técnica de autotransplante heterotópico de tecido ovariano equino, após exposição ou não dos fragmentos ovarianos ao processo de resfriamento e/ou VEGF antes do enxerto (Fase 1); 2) Avaliar o efeito da exposição prévia de tecidos ovarianos equinos ao resfriamento, criopreservação e VEGF no xenotransplante heterotópico. (Fase 2). Na fase 1, os fragmentos ovarianos foram coletados por biópsia in vivo e autoenxertados no sítio subcutâneo do pescoço da égua. Na fase 2, ovários equinos foram coletados por ovariectomia, em seguida fragmentados, vitrificados, expostos ao VEGF e xenoenxertados na parede intraperitoneal de camundongos BALB nude. Na fase 1, a exposição dos fragmentos ovarianos ao VEGF não foi benéfica para a qualidade do tecido; contudo, o processo de resfriamento dos fragmentos reduziu (P < 0,05) a hiperemia aguda pós-enxertia. Os enxertos resfriados comparados com enxertos não resfriados obtiveram valores semelhantes (P > 0.05) para folículos pré-antrais normais e em desenvolvimento, densidade vascular e apoptose das células estromais. Na fase 2, A exposição ao VEGF aumentou (P < 0,05) a densidade vascular (vasos novos e maduros) no tecido criopreservado transplantado. Um equilíbrio das fibras de colágeno dos tipos I e III no tecido transplantado e resfriado foi observado em tecido exposto ao VEGF. Em conclusão, a exposição ao VEGF antes do autotransplante não melhorou a qualidade dos tecidos enxertados. No entanto, resfriar o tecido ovariano por pelo menos 24 horas antes do enxerto pode ser benéfico, pois foram obtidas taxas satisfatórias de sobrevivência e ativação folicular e de sobrevivência e proliferação de células estromais, bem como aumento da densidade de vasos.

The objectives of this study were: 1) To evaluate the efficiency of the heterotopic autotransplantation technique of equine ovarian tissue, after exposure or not of the ovarian fragments to the cooling process and / or VEGF before the graft (Phase 1); 2) Evaluate the effect of previous exposure of equine ovarian tissues to cooling, cryopreservation and VEGF in heterotopic xenotransplantation. (Level 2). In phase 1, the ovarian fragments were collected by biopsy in vivo and autografted in the subcutaneous site of the mare's neck. In phase 2, equine ovaries were collected by ovariectomy, then fragmented, vitrified, exposed to VEGF and xenografted on the intraperitoneal wall of nude BALB mice. In phase 1, the exposure of ovarian fragments to VEGF was not beneficial for tissue quality; however, the cooling process of the fragments reduced (P <0.05) the acute post-grafting hyperemia. The cooled grafts compared with non-cooled grafts obtained similar values (P> 0.05) for normal and developing preantral follicles, vascular density and apoptosis of stromal cells. In phase 2, VEGF exposure increased (P <0.05) the vascular density (new and mature vessels) in the transplanted cryopreserved tissue. A balance of types I and III collagen fibers in the transplanted and cooled tissue was observed in tissue exposed to VEGF. In conclusion, exposure to VEGF before autotransplantation did not improve the quality of the grafted tissues. However, cooling ovarian tissue for at least 24 hours before the graft can be beneficial, as satisfactory rates of survival and follicular activation and stromal cell survival and proliferation have been achieved, as well as increased vessel density.

Conservação de germoplasma de cracídeos ameaçados por meio de transplantes interespecíficos de células germinativas

Resumo: Na área da biologia da conservação, a capacidade de criopreservar e reviver espécies raras e ameaças é fundamental para a preservação da diversidade genética. Neste sentido, uma abordagem inovadora é utilizar animais hospedeiros estéreis ou parcialmente estéreis para o transplante de células germinativas. Essa tecnologia já foi utilizada anteriormente em mamíferos, porém é de particular importância para aves cuja criopreservação de espermatozoides, oócitos e embriões são ineficientes devido à alta susceptibilidade ao congelamento e a grande quantidade de vitelo. Contudo, a recuperação eficiente do genótipo do doador e a transmissão da linha germinativa a partir dos animais hospedeiros ainda são áreas que precisam ser mais aprofundadas. Dessa forma, nosso grupo de pesquisa vem estudando um método simples, barato e seguro para suprimir a espermatogênese endógena em pintos recém-nascidos através do uso de doses fracionadas de bussulfano. Portanto, foi possível demonstrar através do ganho de peso, consumo de ração, hematócrito, dosagem hormonal, coleta de sêmen, histologia testicular, imunofluorescência, imunohistoqúimica e genética que injeções repetidas (20 mg /kg ou levemente superior) de bussulfano podem ser utilizadas na supressão da espermatogênese endógena e, podem ser empregadas com sucesso no transplante xenogênico de SSC em espécies de aves. Embora testes de progênie não ainda não tenham sido realizados, nossos resultados também indicam que, após esse regime de quimioterapia, algumas células germinativas oriundas de cracídeos foram capazes de sobreviver a manipulação e congelamento e se mantiveram viáveis por até 120 dias após o transplante xenogênico em galos domésticos.

Abstract: In the field of conservation biology, the ability to freeze and revive rare and threatened species is critical for the preservation of genetic diversity. In this regard, an innovative approach is to use sterile or partially sterile host animals for germ cell transplantation. This technology has been used previously in mammals, but is of particular importance for birds whose cryopreservation of sperm, oocytes and embryos are inefficient due to their high susceptibility to freezing and large amount of yolk. However, the efficient recovery of donor genotype and germline transmission to host animals are areas that still need to be further addressed. Thus, our research group has been developing a simple, inexpensive and safe method to suppress endogenous spermatogenesis in newly hatched chicks by using fractionated doses of busulfan. Our findings demonstrated through survival, body weight, feed intake, hematocrit test, testosterone measurement, semen analysis, testicular histology, immunofluorescence, immunohistochemistry and molecular analysis that fractionated administration of busulfan (20 mg / kg or slightly higher) can be employed to suppress endogenous spermatogenesis in newly hatched chicks, and can be successfully applied in xenogeneic SSC transplantation in birds. Although progeny tests have not yet been performed, our data also indicate that following this chemotherapy regimen curassow germ cells were capable of withstanding processing and cryopreservation, and remained viable for up to 120 days after xenogeneic transplantation to chicken recipients.

IDADE DA DOADORA E DIFERENTES GÊNEROS RECEPTORES: RESPOSTAS AO XENOTRANSPLANTE OVARIANO OVINO POR LONGO PERÍODO DE CULTIVO

O estoque de folículos primordiais e primários existente em ovários fetais representa um potencial inexplorado que pode ser cultivado para fins de reprodução, preservação ou pesquisa. Adicionalmente, a utilização de receptores masculinos imunodeficientes no xenotransplante ovariano fornece mais uma oportunidade de aproveitamento de material genético que poderia ser perdido. Dessa forma, objetivou-se avaliar o desenvolvimento e viabilidade do tecido ovariano ovino, na fase fetal e na fase pré-pubere, xenotransplantado a fresco, em diferentes linhagens e sexo de camundongos imunossuprimidos. Para o primeiro experimento, ovários de fetos ovinos (100-140 dias) foram colhidos após o abate de suas genitoras, divididos em pequenos fragmentos (1 mm3) que foram destinados a avaliação controle e ao xenotransplante a fresco. Foram utilizadas cinco receptoras da linhagem C57BL/6 SCID para o xenotransplante. Cinco dias após o procedimento cirúrgico, as camundongas receptoras foram submetidas ao lavado vaginal durante 60 dias. Ao final desse período foram eutanasiadas e procedeu-se com a coleta dos transplantes para avaliações macro e microscópicas. Observou-se que em 80% das fêmeas receptoras o padrão citológico do lavado vaginal alternou entre diestro-proestro-diestro, não sendo observadas as fases de estro e metaestro durante o período experimental. Na análise histológica foi constatado que a neovascularização ocorreu em 80% dos tecidos recuperados. Observou-se também folículos pré-antrais e antrais (menores) e sem alterações morfológicas, no entanto, não foram obtidos folículos antrais com mais de 1mm. Corpos lúteos também não foram visualizados. No segundo experimento, fragmentos ovarianos (1 mm3) de ovelhas jovens foram xenotransplantados a fresco em receptores machos da linhagem C57BL/6 SCID (n = 5) e BALB/c Nude (n = 5). Após 65 dias do xenotransplante, os animais foram eutanasiados e os transplantes avaliados quanto às características macroscópicas, microscópicas e o desenvolvimento oocitário in vitro. Foi observado nos ovários recuperados dos animais da linhagem C57BL/6 SCID grande consumo folicular. Dos folículos morfologicamente normais restantes, a maioria era primordial. Adicionalmente, áreas com tecido cicatricial semelhante ao corpo albicans também foram encontradas. Nos transplantes recuperados dos animais da linhagem BALB/c Nude foi observado consumo folicular moderado, apresentando baixa taxa de folículos primordiais e primários normais e alta proporção de primordiais atrésicos. Adicionalmente, recuperou-se um oócito, o qual foi submetido à maturação, fecundação e cultivo in vitro sem, contudo, apresentar desenvolvimento embrionário. Considerando que utilizou-se doadoras da mesma espécie, conclui-se que a idade da doadora, a espécie receptora e o período para a coleta do tecido ovariano devem ser adaptados para melhores resultados.

The stock of primordial and primary follicles in fetal ovaries represents an untapped potential that can be cultivated for purposes of reproduction, preservation or research. Additionally, the use of male immunodeficient receptors in the ovarian xenograft provides more opportunity to use genetic material that could be lost. Thus, the objective was to evaluate the development and viability of ovarian ovine tissue, in the fetal phase and in the prepubertal phase, freshly grafted, in different strains and sex of immunosuppressed mice. For the first experiment, ovaries from fetal sheep (100-140 days old) were harvested after slaughtering their mothers, divided into small fragments (1 mm3) that were destined for control evaluation and fresh xenotransplantation. Five C57BL/6 SCID strain recipients were used for xenotransplantation. Five days after the surgical procedure, the recipient mice were subjected to vaginal lavage for 60 days. At the end of this period, they were euthanized and the grafts were collected for macro and microscopic evaluations. It was observed that in 80% of the receiving females the cytological pattern of the vaginal lavage alternated between diestrus-proestrus-diestrus, with the estrus and metestrus phases not being observed during the experimental period. Histological analysis showed that neovascularization occurred in 80% of the recovered tissues. Pre-antral and antral follicles (smaller) and without morphological changes were also observed, however, antral follicles larger than 1 mm were not obtained. Corpus luteum was also not seen. In the second experiment, ovarian fragments (1 mm3) from young sheep were xenotransplanted fresh into male recipients of the C57BL/6 SCID (n = 5) and BALB/c Nude (n = 5) lines. After 65 days of xenograft, the animals were euthanized and the grafts were evaluated for macroscopic and microscopic characteristics and oocyte development in vitro. It was observed in the tissues recovered from animals of the C57BL / 6 SCID strain a high follicular consumption. Of the remaining morphologically normal follicles, most were primordial. Additionally, areas with scar tissue similar to the corpus albicans were also found. In grafts recovered from animals of the BALB/c Nude strain, moderate follicular consumption was observed, with a low rate of normal primordial and primary follicles and a high proportion of primordial atretic follicles. Additionally, an oocyte was recovered, which was subjected to maturation, fertilization and in vitro culture without, however, showing embryonic development. Considering that donors of the same species were used, it is concluded that the age of the donor, the recipient species and the period for the collection of ovarian tissue must be adapted for better results.

Xenotransplante em camundongos imunossuprimidos coletado por meio de ovariectomia unilateral total vídeolaparoscópica em ovelha / Xenotransplantation in immunosuppressed mice collected from total unilateral laparoscopic ovariectomy in sheep

Objetivou-se neste estudo descrever a técnica de xenotransplante gonadal em camundongosimunossuprimidos por meio de ovariectomia unilateral total videolaparoscópica (OVL) em ovelhas. Foramutilizadas quatro ovelhas como doadoras do tecido reprodutivo e camundongos em fase reprodutiva (n = 12)como receptores. As coletas foram realizadas por videocirurgia, e foram avaliados o tempo de cirurgia, as respostascomportamentais antiálgicas, o apetite, o escore corporal e a locomoção durante 10 dias pós-operatórios. Osxenotransplantes foram realizados na cápsula renal dos camundongos, sendo avaliados histologicamente 60 diasapós o transplante. O tempo de cirurgia foi de 18 ± 3 min. A técnica OVL apresentou-se minimamente invasiva,sem complicações cirúrgicas, proporcionando mínimo desconforto e ótima recuperação dos animais, e pode serempregada em ovelhas adultas e pré-púberes para coleta de tecidos reprodutivos para conservação de gametas. Parahistologia dos tecidos xenotransplantados, verificou-se viabilidade tecidual, com neovascularização e ausência defocos necróticos, porém não se visualizaram folículos nas diferentes fases. Concluiu-se que a OVL pode ser atécnica empregada em ovelhas pré-púberes e adultas para recuperação de tecido reprodutivo paraxenotransplante. Para o xenotransplante, sugere-se que os fragmentos ovarianos selecionados contenham umnúmero suficiente de folículos primordiais para o possível sucesso da biotécnica.(AU)

The aim of this study was to describe the technique of gonadal xenotransplantation inimmunosuppressed mice from total unilateral laparoscopic ovariectomy (OVL) in sheep. Four sheep were usedas donors of reproductive tissue in mice in the reproductive phase (n = 12) as receivers. Samples were collectedby laparoscopic surgery, evaluating the time of surgery, observation of behavioral anti-painful responses,monitoring appetite, body condition score and locomotion for 10 days postoperatively. The xenografts wereperformed in the renal capsule of mice, as evaluated histologically 60 days after transplantation. The operationtime was 18 ± 3 min, the technique presented OVL minimally invasive surgical complications without providingminimum discomfort and optimum recovery of the animals and can be used in adult and prepubertal sheep forcollecting reproductive tissues for the conservation of gametes. Histology tissue xenotransplanteted was a viabletissue, with neovascularization and absence of necrotic foci, but follicles at different stages were not visualized.It was concluded that the OVL technique can be employed in sheep and adult prepubertal for recoveringreproductive tissue for xenotransplantation. For xenotransplantation, it is suggested that the ovarian fragmentsselected contain a sufficient number of primordial follicles for the possible success of biotech.(AU)