Assessment of different in vitro sperm challenges and in vivo fertility of bovine semen batches / Avaliação de diferentes desafios espermáticos in vitro e da fertilidade in vivo de partidas de sêmen bovino

The aim of this work was to submit sperm cells to different laboratory challenges and to compare in vitro results with in vivo semen fertility. Four different batches from the same Brangus bull were used in a timed-AI program of 332 Brangus cows. Each batch (B) was submitted to the following procedure: semen sample was thawed at 36°C for 30 seconds (control). Sperm motility parameters, plasma membrane integrity, sperm morphology, and concentration were assessed. Then, an aliquot of thawed sample was incubated in a water bath at 45°C for 40 min (thermal challenge group; TCG) and another aliquot was centrifuged at 500 xg (Percoll gradient 45%/90%) for 15 min (centrifugation challenge group; CCG). Centrifuged semen was also submitted to another thermal challenge, being incubated (water bath) at 45°C for 40 min (centrifugation + thermal challenge group; CTCG). At the end of each challenge (CCG, TCG, and CTCG), the same laboratory tests used for control group were repeated. The following conception rates (CR) were observed for each batch: B1 = 48.9% (44/90); B2 = 44.2% (23/52); B3 = 55.5% (40/72); B4 = 43.2% (51/118); (p < 0.10). In the lab, B3 presented higher (p ≤ 0.05) progressive motility (PM) than B4 after thawing (control group) and after all sperm challenges (TCG, CCG, and CTCG). However, despite B3 and B4 having demonstrated a similar percentage of plasma membrane integrity (PMI) to the control group (B3 = 66.7 ± 1.3 and B4 = 65.2 ± 3.3), B3 demonstrated higher (P ≤ 0.05) percentage of PMI (37.2 ± 2.5) than B4 (26.7 ± 3.3) after passing through the most stressing in vitro challenge (CTCG). The semen batch presenting the highest resistance to in vitro challenges was the one that presented a trend for higher in vivo fertility, suggesting that submitting semen samples to laboratory challenges may be an interesting alternative for selecting batches with greater field fertility.(AU)

O objetivo deste estudo foi estressar células espermáticas em diferentes desafios laboratoriais e comparar os resultados in vitro com a fertilidade in vivo do sêmen. Quatro partidas de um mesmo touro Brangus foram utilizadas em um programa de IATF de 332 vacas Brangus. Cada partida foi submetida ao seguinte procedimento: a amostra de sêmen foi descongelada a 36°C por 30 segundos (grupo controle). Foram avaliados parâmetros de motilidade espermática (CASA), integridade da membrana plasmática (PMI), morfologia e concentração espermática. Em seguida, uma alíquota da amostra descongelada foi incubada em banho-maria a 45°C durante 40 minutos (grupo de desafio térmico, TCG) e outra alíquota foi centrifugada a 500 xg (gradiente de Percoll 45%/90%) durante 15 min (grupo desafio de centrifugação, CCG). Uma aliquota do sêmen centrifugado foi ainda submetida ao desafio térmico, sendo incubado a 45°C durante 40 min (grupo de desafio térmico + centrifugação, CTCG). No final de cada desafio (CCG, TCG e CTCG), os mesmos testes laboratoriais utilizados para o grupo de controle foram realizados. A seguinte taxa de concepção (CR) foi observada para cada partida (B): B1 = 48,9% (44/90), B2 = 44,2% (23/52), B3 = 55,5% (40/72) e B4 = 43,2% (51/118); (P < 0,10). No laboratório, B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) motilidade progressiva (PM) do que B4 logo após o descongelamento (grupo controle) e após todos os desafios laboratoriais (TCG, CCG e CTCG). Porém, apesar de B3 e B4 demonstrarem similar porcentagem de PMI no grupo controle (B3 = 66,7 ± 1,3 e B4 = 65,2 ± 3,3), B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) PMI (37,2 ± 2,5%) do que B4 (26,7 ± 3,3%) após passar pelo maior desafio laboratorial (CTCG). A partida seminal que in vitro apresentou maior resistência aos desafios laboratoriais foi a mesma que apresentou tendência para maior fertilidade in vivo. Assim, sugere-se que submeter amostras seminais a desafios laboratoriais pode ser uma alternativa interessante para selecionar partidas com maior fertilidade a campo.(AU)

Assessment of different in vitro sperm challenges and in vivo fertility of bovine semen batches / Avaliação de diferentes desafios espermáticos in vitro e da fertilidade in vivo de partidas de sêmen bovino

The aim of this work was to submit sperm cells to different laboratory challenges and to compare in vitro results with in vivo semen fertility. Four different batches from the same Brangus bull were used in a timed-AI program of 332 Brangus cows. Each batch (B) was submitted to the following procedure: semen sample was thawed at 36°C for 30 seconds (control). Sperm motility parameters, plasma membrane integrity, sperm morphology, and concentration were assessed. Then, an aliquot of thawed sample was incubated in a water bath at 45°C for 40 min (thermal challenge group; TCG) and another aliquot was centrifuged at 500 xg (Percoll gradient 45%/90%) for 15 min (centrifugation challenge group; CCG). Centrifuged semen was also submitted to another thermal challenge, being incubated (water bath) at 45°C for 40 min (centrifugation + thermal challenge group; CTCG). At the end of each challenge (CCG, TCG, and CTCG), the same laboratory tests used for control group were repeated. The following conception rates (CR) were observed for each batch: B1 = 48.9% (44/90); B2 = 44.2% (23/52); B3 = 55.5% (40/72); B4 = 43.2% (51/118); (p < 0.10). In the lab, B3 presented higher (p ≤ 0.05) progressive motility (PM) than B4 after thawing (control group) and after all sperm challenges (TCG, CCG, and CTCG). However, despite B3 and B4 having demonstrated a similar percentage of plasma membrane integrity (PMI) to the control group (B3 = 66.7 ± 1.3 and B4 = 65.2 ± 3.3), B3 demonstrated higher (P ≤ 0.05) percentage of PMI (37.2 ± 2.5) than B4 (26.7 ± 3.3) after passing through the most stressing in vitro challenge (CTCG). The semen batch presenting the highest resistance to in vitro challenges was the one that presented a trend for higher in vivo fertility, suggesting that submitting semen samples to laboratory challenges may be an interesting alternative for selecting batches with greater field fertility.(AU)

O objetivo deste estudo foi estressar células espermáticas em diferentes desafios laboratoriais e comparar os resultados in vitro com a fertilidade in vivo do sêmen. Quatro partidas de um mesmo touro Brangus foram utilizadas em um programa de IATF de 332 vacas Brangus. Cada partida foi submetida ao seguinte procedimento: a amostra de sêmen foi descongelada a 36°C por 30 segundos (grupo controle). Foram avaliados parâmetros de motilidade espermática (CASA), integridade da membrana plasmática (PMI), morfologia e concentração espermática. Em seguida, uma alíquota da amostra descongelada foi incubada em banho-maria a 45°C durante 40 minutos (grupo de desafio térmico, TCG) e outra alíquota foi centrifugada a 500 xg (gradiente de Percoll 45%/90%) durante 15 min (grupo desafio de centrifugação, CCG). Uma aliquota do sêmen centrifugado foi ainda submetida ao desafio térmico, sendo incubado a 45°C durante 40 min (grupo de desafio térmico + centrifugação, CTCG). No final de cada desafio (CCG, TCG e CTCG), os mesmos testes laboratoriais utilizados para o grupo de controle foram realizados. A seguinte taxa de concepção (CR) foi observada para cada partida (B): B1 = 48,9% (44/90), B2 = 44,2% (23/52), B3 = 55,5% (40/72) e B4 = 43,2% (51/118); (P < 0,10). No laboratório, B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) motilidade progressiva (PM) do que B4 logo após o descongelamento (grupo controle) e após todos os desafios laboratoriais (TCG, CCG e CTCG). Porém, apesar de B3 e B4 demonstrarem similar porcentagem de PMI no grupo controle (B3 = 66,7 ± 1,3 e B4 = 65,2 ± 3,3), B3 apresentou maior (P ≤ 0,05) PMI (37,2 ± 2,5%) do que B4 (26,7 ± 3,3%) após passar pelo maior desafio laboratorial (CTCG). A partida seminal que in vitro apresentou maior resistência aos desafios laboratoriais foi a mesma que apresentou tendência para maior fertilidade in vivo. Assim, sugere-se que submeter amostras seminais a desafios laboratoriais pode ser uma alternativa interessante para selecionar partidas com maior fertilidade a campo.(AU)

Espermatozoides epididimários: refrigeração e criopreservação / Epididymal spermatozoa: refrigeration and criopreservation

A recuperação de espermatozoides epididimários após a morte possibilita a utilização do material genético de reprodutores de interesse zootécnico que morrem inesperadamente e de espécimes selvagens ou ameaçadas de extinção. O período máximo após a morte pelo qual os espermatozoides permanecem viáveis varia conforme a temperatura de armazenamento dos epidídimos. A refrigeração e a congelação são os métodos utilizados para preservação espermática, contudo os espermatozoides epididimários apresentam peculiaridades em seus processos de preservação. A refrigeração de espermatozoides epididimários pode ser realizada in situ ou in vitro, sendo que estas duas formas de refrigeração apresentam vantagens e desvantagens inerentes às técnicas. Os espermatozoides epididimários apresentam maior resistência à variações de temperatura e osmolaridade que tornam os processos de preservação diferentes dos aplicados ao sêmen colhido em vagina artificial ou eletroejaculação. Esta revisão visa foi compilar trabalhos referentes à recuperação e preservação espermática epididimária.(AU)

The recovery of epididymal spermatozoa after death is used to avail genetic material of breeding herders of zootechnical interest who die unexpectedly and of wild or endangered species. The maximum post mortem period by which sperm remain viable varies with the storage temperature of the epididymis. Refrigeration and cryopreservation are methods for sperm preservation, however, epididymal spermatozoa present peculiarities in their preservation processes. The cooling of epididymal spermatozoa can be performed in situ or in vitro, these two forms of refrigeration have advantages and disadvantages inherent in the techniques. The epididymal spermatozoa have greater resistance to variations in temperature and osmolarity that make conservation processes different from those applied to semen collected in an artificial vagina or electroejaculation. This review aims to compile works referring to epididymal sperm retrieval and preservation.(AU)

Espermatozoides epididimários: refrigeração e criopreservação / Epididymal spermatozoa: refrigeration and criopreservation

A recuperação de espermatozoides epididimários após a morte possibilita a utilização do material genético de reprodutores de interesse zootécnico que morrem inesperadamente e de espécimes selvagens ou ameaçadas de extinção. O período máximo após a morte pelo qual os espermatozoides permanecem viáveis varia conforme a temperatura de armazenamento dos epidídimos. A refrigeração e a congelação são os métodos utilizados para preservação espermática, contudo os espermatozoides epididimários apresentam peculiaridades em seus processos de preservação. A refrigeração de espermatozoides epididimários pode ser realizada in situ ou in vitro, sendo que estas duas formas de refrigeração apresentam vantagens e desvantagens inerentes às técnicas. Os espermatozoides epididimários apresentam maior resistência à variações de temperatura e osmolaridade que tornam os processos de preservação diferentes dos aplicados ao sêmen colhido em vagina artificial ou eletroejaculação. Esta revisão visa foi compilar trabalhos referentes à recuperação e preservação espermática epididimária.

The recovery of epididymal spermatozoa after death is used to avail genetic material of breeding herders of zootechnical interest who die unexpectedly and of wild or endangered species. The maximum post mortem period by which sperm remain viable varies with the storage temperature of the epididymis. Refrigeration and cryopreservation are methods for sperm preservation, however, epididymal spermatozoa present peculiarities in their preservation processes. The cooling of epididymal spermatozoa can be performed in situ or in vitro, these two forms of refrigeration have advantages and disadvantages inherent in the techniques. The epididymal spermatozoa have greater resistance to variations in temperature and osmolarity that make conservation processes different from those applied to semen collected in an artificial vagina or electroejaculation. This review aims to compile works referring to epididymal sperm retrieval and preservation.

ADIÇÃO DE COLESTEROL LIGADO À CICLODEXTRINA NO PROCESSAMENTO DE ESPERMATOZOIDES EQUINOS CRIOPRESERVADOS E ADIÇÃO DE ESTIMULANTES DA MOTILIDADE NO PÓS DESCONGELAMENTO

Este estudo propôs avaliar o efeito da adição de colesterol ligado à ciclodextrina (CLC) antes do processo de criopreservação e estimulantes de motilidade após o descongelamento (Fert Talp - FT e Pentoxifilina - PTX), sobre a cinética espermática (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP e LIN), integridade de membrana plasmática, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, potencial mitocondrial, desestabilização da membrana plasmática e fertilidade in vivo. Foram criopreservados dois ejaculados de 12 garanhões e cada ejaculado foi subdividido em quatro grupos: G1 (sem CLC), G2 (1mg de CLC), G3 (1,5mg de CLC) e G4 (2mg de CLC). No experimento I o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos após a inclusão de CLC (G1-G4) e avaliar a longevidade celular pelo teste de Termorresitência - TTR após o descongelamento: imediatamente (T0), 40 minutos (T40), 80 minutos (T80) e 120 minutos (T120). Além disso, objetivou-se avaliar o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. No experimento II o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante FT (20% - v/v) após o descongelamento, quanto a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos) e avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular. No experimento III o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante PTX (20% - v/v) após o descongelamento, avaliar a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos), avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular, o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. Além disso, objetivou-se avaliar a fertilidade do sêmen criopreservado em três grupos: 1) Grupo controle (sem CLC); 2) Grupo 1,5mg de CLC; e 3) Grupo 1,5 mg de CLC + PTX. No experimento I, os grupos G3 e G4 apresentaram valores superiores de VCL, VSL e VAP. No T0 os parâmetros de MT e MP foram superiores no G3. Quanto ao potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana não foram observadas diferenças significativas entre os grupos (p<0,05). No experimento II, a adição de FT foi benéfica à velocidade espermática (VCL, VSL e VAP) em alguns grupos experimentais e em tempos diferentes. O G2 com FT demonstrou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra e sem peróxido de hidrogênio em comparação aos grupos sem adição do estimulante. No experimento III, a adição de PTX não foi benéfica aos parâmetros de cinética após o descongelamento ao decorrer do tempo em alguns grupos experimentais. No grupo G1 com PTX notou-se superioridade de células com membrana lesionada com peróxido de hidrogênio em comparação ao G4 com PTX e uma maior população celular com membranas íntegras sem peróxido de hidrogênio no grupo G4 com PTX em comparação ao G2 com PTX. A taxa de concepção nos grupos G1, G2 e G3 foram 50%, 66,7% e 66,7%, respectivamente. A adição de CLC melhorou os parâmetros cinéticos in vitro, sendo que as concentrações de 1,5 mg e 2 mg conferiram melhor resistência ao processo de criopreservação. A adição de FT conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática. Em contrapartida, a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. Além disso, a inclusão de CLC não demostrou prejudicar a taxa de concepção em inseminações realizadas após a ovulação. Mediante os resultados encontrados no atual trabalho, pode-se concluir que as concentrações de CLC que melhor conferiram resistência aos espermatozoides ao processo de criopreservação com consequente incremento cinético às células espermáticas foram 1,5 mg e 2 mg. Os achados com a adição do estimulante FT, considerando-o estimulante de motilidade através do aumento no metabolismo celular, conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática, sendo essa uma atribuição satisfatória além de conferir também maiores populações celulares com membrana plasmática íntegra sem a produção de peróxido de hidrogênio. Em contrapartida a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. E quanto a fertilidade do sêmen criopreservado, os resultados encontrados com a utilização de colesterol ligado a ciclodextrina não interferiu na fertilidade. Dessa forma, o colesterol ligado à ciclodextrina é benéfico à célula espermática ao processo de criopreservação, entretanto a adição de estimulante causou efeitos divergentes, aumentando os parâmetros e a longevidade celular (FT) ou diminuindo os parâmetros de cinética com o tempo (PTX).

The current study proposed to evaluate the effect of the addition of cholesterol bound to cyclodextrin (CLC) before the cryopreservation process and motility stimulants post thawed (fert talp FT and pentoxifylline PTX) on the spermatic kinetics (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP and LIN), membrane integrity, production of intracellular hydrogen peroxide, mitochondrial potential, destabilization of the plasma membrane and in vivo fertility. Two ejaculates of 12 stallions were cryopreserved; subdivided into four experimental groups: G1 (no CLC); G2 (1 mg of CLC), G3 (1.5 mg of CLC) and G4 (2 mg of CLC). In experiment I, the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4), to evaluate cell longevity through the thermoresistance test - TTR post thawed: immediately (T0), 40 minutes (T40), 80 minutes (T80) and 120 minutes (T120). In addition, mitochondrial potential and membrane destabilization were evaluated. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4) and the addition of the stimulant FT, to evaluate cell longevity (TTR) post thawed (T0, T40, T80 and T120) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant FT (20% - v/v) post thawed, as to the cellular longevity (TTR T0, T40, T80 and T120 minutes) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment III the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant PTX (20% - v/v) post thawed, to evaluate cellular longevity (TTR - T0, T40, T80 and T120 minutes), to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide, the mitochondrial potential and the membrane destabilization. In addition, to evaluate the fertility of the cryopreserved semen in three groups: 1) Control group: no cholesterol addition; 2) Group cholesterol: 1.5 mg, and 3) Group cholesterol 1.5 mg + PTX. In experiment I, groups G3 and G4 presented superior values of VCL, VSL and VAP. In T0, the parameters of MT and MP were superior in G3. As to mitochondrial potential and membrane destabilization, no meaningful differences were observed between the groups (p<0.05). In experiment II, the addition of FT was beneficial to spermatic speed (VCL, VSL and VAP) in some experimental groups and in different times. G2 with FT has demonstrated higher percentage of cells with intact membrane and without hydrogen peroxide in comparison to groups without the addition of the stimulant. In experiment III, the addition of PTX was not beneficial to the kinetics parameters post thawed along time in some experimental groups. In the group G1 with PTX it was observed superiority in cells with injured membrane and with hydrogen peroxide in comparison to G4 with PTX and a higher cell population with intact membranes and without hydrogen peroxide in the group G4 with PTX in comparison to G2 with PTX. The conception rate in the groups G1, G2 and G3 was, respectively, 50%, 66.7% and 66.7%. In this way, it is possible to conclude that the addition of the cholesterol bounded to cyclodextrin is beneficial to the spermatic cell in the cryopreservation process, however, the addition of stimulants post thawed has caused divergent effect. The stimulant FT has provided longevity and superiority to the spermatic velocity parameters. In contrast, the addition of the stimulant PTX has compromised the cellular longevity. In addition, the inclusion of CLC has not affected the conception rate in inseminations carried out after the ovulation.

Análise do óleo essencial de Origanum majorana relacionada ao seu potencial tóxico e antineoplásico

O câncer é apontado como um problema de saúde pública de proporções mundiais, 11 uma vez que as taxas de incidência são crescentes, a mortalidade é alta e as 12 opções de tratamento farmacológico disponíveis apresentam efeitos adversos 13 graves e vêm perdendo sua eficácia ao longo do tempo, devido ao desenvolvimento 14 de mecanismos de resistência pelas células neoplásicas. Frente a essa realidade, a 15 indústria farmacêutica tem nas plantas medicinais um amplo painel de moléculas 16 potencialmente eficazes e menos tóxicas a serem estudadas. A tualmente já está 17 cientificamente comprovado qu e os compostos químicos presentes nas plantas 18 medicinais podem proteger as células de eventos carcinogênicos, agindo contra a 19 promoção e a progressão tumorais. Porém, os mesmos princípios ativos que 20 conferem as propriedades terapêuticas a essas plantas, ta mbém podem ser os 21 responsáveis pelos seus efeitos tóxicos e reações adversas. Nesse contexto, o 22 presente trabalho tem como objetivos estudar a citotoxicidade do óleo essencial de 23 Origanum majorana (OEOM) em células espermáticas suínas e hemácias e o seu 24 me canismo de ação intracelular em linhagens celulares não neoplásicas (MDBK 25 Madin Darby Bovine Kidney) e neoplásicas (B16F10 melanoma murino) e 26 determinar a sua composição química. A determinação da toxicidade do OEOM in 27 vitro foi avaliada nas células es permáticas através de parâmetros de cinética (CASA 28 = Computer Assisted Sperm Analisys) e de estrutura (citometria de fluxo), o 29 mecanismo de ação nas células MDBK e B16F10 foi avaliado por citometria de fluxo, 30 e a atividade hemolítica em eritrócitos caninos , pelo teste em meio líquido e em meio 31 sólido com ágar sangue de ovinos. Para a identificação dos compostos químicos do 32 óleo essencial foi utilizado cromatógrafo a gás acoplado a detector de massas 33 (GC/MS QP 2010SE Shimadzu, Japão), equipado com auto injet or AOC 20i. As 34 quantificações foram feitas por área normatizada e as identificações dos compostos 35 pelo espectrômetro de massas, utilizando a biblioteca NIST 8 do GC/MS. O OEOM é 36 composto majoritariamente por terpenos, principalmente por gama terpinen o , cis 37 sabineno hidratado e 4 terpineol. Na avaliação imediata da cinética espermática o 38 OEOM reduziu a motilidade total (MT) e progressiva (MP) e a distância média 39 percorrida (DAP) em todas as concentrações testadas, enquanto que, após 24 horas, 40 as concentraçõe s tóxicas foram de 1 a 4 mg.mL 1 . Na citometria de fluxo, as 41 estruturas afetadas foram as mitocôndrias (PMM) em todas as concentrações e a 42 membrana, que teve a sua fluidez reduzida com 0,25 e 1 mg.mL 1 de OEOM. As 43 concentrações de OEOM capazes de provocar hemólise em ambos os tipos 44 celulares foram 1, 2 e 4 mg.mL 1 , chegando a percentuais de 90 a 100% de hemólise. 45 Nos testes com a linhagem celular MDBK observou se redução de espécies reativas 46 de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações utilizadas de utilizadas de 1 OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, 2 os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e 3 aumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mLaumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mL--1 1 4 causaram redução na flcausaram redução na fluidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, uidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, 5 respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram 6 na concentração de 0,5 mg.mLna concentração de 0,5 mg.mL--11.. Os resultados obtidos nesse estudo apontam para Os resultados obtidos nesse estudo apontam para 7 a elevada toxicidade celular demonstrada, pra elevada toxicidade celular demonstrada, principalmente, nas concentrações entre incipalmente, nas concentrações entre 8 1 e 4 mg.mL1 e 4 mg.mL--11 do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto 9 ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático 10 para as células neoplásicas utilizadas, devido à interferênciapara as células neoplásicas utilizadas, devido à interferência no ciclo celular, sem no ciclo celular, sem 11 exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados 12 à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi 13 alterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando osalterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando os 14 resultados desse estudo, concluiresultados desse estudo, conclui--se que o OEOM é uma promissora fonte de se que o OEOM é uma promissora fonte de 15 moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é 16 capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, 17 mesmo em concentrações mesmo em concentrações baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células 18 sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e 19 não foi observada nas células MDBK.não foi observada nas células MDBK.

Cancer is identified as a public health problem of worldwide proportions, since 12 incidence rates are increasing, mortality is high and the pharmacological treatment 13 options available have serious adverse effects and have been losing their 14 effectiveness over time due to the development of resistance mechanisms by 15 neoplastic cells. Faced with this reality, the pharmaceutical industry has in medicinal 16 plants a wide panel of potentially effective and less toxic molecules to be studied. It is 17 now scientifically proven that chemical compounds present in medicinal plants can 18 protect cells from carcinogenic events, acting against tumor promotion and 19 progression. However, the same active ingredients that give therapeutic properties to 20 these plants, may also be responsible for their toxic effects and adverse reactions. In 21 this context, the present work aims to study the cytotoxicity of the essential oil of 22 Origanum majorana (OEOM) in swine sperm cells and red blood cells and its 23 mechanism of intracellular action in non-neoplastic (MDBK - Madin Darby Bovine 24 Kidney) and neoplastic cell lines ( B16F10 - murine melanoma) and determine its 25 chemical composition. The determination of OEOM toxicity in vitro was evaluated in 26 sperm cells through kinetic parameters (CASA = Computer Assisted Sperm 27 Analyzes) and structure (flow cytometry), the mechanism of action in MDBK and 28 B16F10 cells was evaluated by flow cytometry. , and hemolytic activity in canine 29 erythrocytes, by testing in liquid and solid media with sheep blood agar. For the 30 identification of the chemical compounds of the essential oil, a gas chromatograph 31 coupled to a mass detector (GC / MS-QP 2010SE-Shimadzu, Japan) was used, 32 equipped with an AOC-20i auto injector. The quantifications were made by 33 standardized area and the identification of the compounds by the mass spectrometer, 34 using the NIST 8 library of the GC / MS. OEOM is composed mainly of terpenes, 35 mainly gamma-terpineno, cis-sabinene hydrate and 4-terpineol. In the immediate 36 evaluation of sperm kinetics, OEOM reduced total (MT) and progressive (MP) motility 37 and average distance traveled (DAP) in all concentrations tested, whereas, after 24 38 hours, toxic concentrations were 1 to 4 mg.mL -1. In flow cytometry, the affected 39 structures were the mitochondria (PMM) in all concentrations and the membrane, 40 which had its fluidity reduced with 0.25 and 1 mg.mL-1 of OEOM. The concentrations 41 of OEOM capable of causing hemolysis in both cell types were 1, 2 and 4 mg.mL-1, 42 reaching percentages of 90 to 100% of hemolysis. In tests with the MDBK cell line, a 43 reduction in reactive oxygen species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) was 44 observed in all concentrations of OEOM used in MDBK cells, and also in the S phase 45 of the cell cycle. In B16F10 cells, treatments with OEOM reduced ROS and G2 cells 1 and increased cells in S phase. The concentrations of 0.25 and 0.5 mg.mL-1 caused 2 a reduction in fluidity and an increase in membrane potential mitochondrial, 3 respectively in the MDBK lineage, while LPO in B16F10 cells decreased in the 4 concentration of 0.5 mg.mL-1. The results obtained in this study point to the high 5 cellular toxicity demonstrated, mainly, in the concentrations between 1 and 4 mg.mL-1 6 of the OEOM in the swine sperm cells and in the erythrocytes. As for the mechanism 7 of action of the OEOM, it is possible to assume that its effect is cytostatic for the 8 neoplastic cells used, due to the interference in the cell cycle, without exerting toxic 9 effects in the MDBK lineage, since the parameters related to the plasma membrane 10 and production and ERO reduced. Cell viability was not altered in any of the strains 11 used in the tests. Considering the results of this study, it is concluded that OEOM is a 12 promising source of molecules with therapeutic potential for the treatment of cancer, 13 since it is able to promote the interruption of cell proliferation of the neoplastic 14 lineage, even at low concentrations. The toxicity shown by OEOM in blood and 15 sperm cells was more evident at higher concentrations and was not seen in MDBK 16 cells.

Influência do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado sobre a capacitação e hiperativação espermática em sêmen suíno conservado sob refrigeração à 17 °C por 72 horas

Resumo: A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado nas inseminações artificiais. Substâncias protetoras presentes nos diluidores comerciais atuam cada vez mais em favor da manutenção da viabilidade celular durante esta etapa. Entretanto, embora alterações estruturais e principalmente funcionais muitas vezes não sejam identificadas nas análises empregadas rotineiramente para avaliação da qualidade seminal, a ocorrência das mesmas em resposta as baixas temperaturas de armazenamento e seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro, gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17 °C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen (CASA); e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Além disso, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de interação entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade do espermatozoide quando avaliada sob condições de capacitação in vitro, podendo ainda ser observada maior resistência às lesões de acrossoma em espermatozoides preservados sob esta condição (P < 0,05). O presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao seu armazenamento à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à qualidade e funcionalidade espermática.

Abstract: Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Commercial extenders increasingly work in favor of maintaining sperm viability during this period by its protective substances. However, although structural and mainly functional changes are often not identified in the routine semen evaluation, their occurrence in response to low storage temperatures and their direct effects on sperm fertilizing ability have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during the liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of interaction between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality when evaluated under conditions of in vitro capacitation. Furthermore, boar sperm stored under this condition present a greater resistance to acrosome damages when compared to others (P < 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage at 17 °C for 72 hours is not detrimental to sperm quality and functionality.

Características espermáticas do sêmen criopreservado bovino submetido a desafio térmico pelo calor

A criopreservação de sêmen de touros superiores é uma poderosa biotécnica reprodutiva, que impacta no melhoramento genético dos rebanhos. O ambiente térmico enfrentado pelos espermatozoides após a descongelação é de grande importância biológica, pois situações extremas podem reduzir a eficiência de sua utilização. No entanto, não se sabe ao certo qual a resistência térmica do espermatozoide criopreservado bovino. Por isso, o trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de três ambientes térmicos in vitro ao longo do tempo nas características do movimento espermático, funcionalidade de compartimentos celulares e fertilidade in vitro de espermatozoides bovinos criopreservados. Foram utilizadas 20 partidas de sêmen criopreservado provenientes de cinco touros da raça Canchim, que corresponderam a um total de quatro partidas por touro. O sêmen foi descongelado e submetido a três tratamentos térmicos distintos: 36,0 °C (T36,0 temperatura de descongelação), 38,0 °C (T38,0 temperatura fisiológica corpórea) e 39,5 °C (T39,5 temperatura inicial de estresse térmico). O sêmen foi avaliado após a descongelação (0 h) e incubado por 4 horas, sendo reavaliado a cada hora (1 h, 2 h, 3 h e 4 h). Na análise estatística foi utilizado um modelo linear misto e modelo linear misto generalizado e teste de Tukey para a comparação de médias. Os tratamentos a 38,0 °C e 39,5 °C prejudicaram a motilidade das células a partir da segunda hora de incubação, assim como o padrão de movimentação espermática, com mais de 50% de células estáticas a partir da terceira hora. A movimentação espermática foi mais prejudicada a 38,0 °C, a partir da segunda hora. Houve incremento nas lesões de membrana nas células mantidas a 39,5 °C. O potencial mitocondrial reduziu com o passar do tempo. Os espermatozoides submetidos a 36,0 °C apresentaram maior fertilidade in vitro. A motilidade total, motilidade progressiva e padrão de movimentação das células foram características relacionadas à produção de embriões in vitro.

Cryopreservation of the sperm of bulls is a reproductive biotechnology, which impacts on the genetic improvement of the herds. The warm environment faced by spermatozoa after thawing is of great biological importance, the extreme situations can reduce the efficiency of their use. However, it is not known which is a thermal tolerance of bovine cryopreserved sperm. The objective of this work was to evaluate the in vitro thermal effects on the characteristics of sperm movement, the cellular compartment function and the in vitro fertility of cryopreserved bovine spermatozoa. Twenty straws of cryopreserved semen from five Canchim bulls were used, which corresponded to a total of four departures per bull. The semen was thawed and subjected to three different heat treatments: 36.0 ° C (T36.0 defrosting temperature), 38.0 ° C (T38.0 body physiological temperature) and 39.5 ° C (T39.5 temperature initial thermal stress). The semen was evaluated after thawing (0 h) and incubated for 4 hours, being reevaluated every hour (1 h, 2 h, 3 h and 4 h). The statistical analysis was used for a linear mixed model and generalized linear model and Tukey's test for a comparison of averages. Treatments at 38.0 ° C and 39.5 ° C impaired cell motility after the second hour of incubation, as well as the sperm movement pattern, with more than 50% static cells from the third hour. The spermatic movement was more impaired at 38.0 ° C, from the second hour. There was an increase in membrane lesions in cells maintained at 39.5 ° C. Mitochondrial potential decreased with time. Spermatozoa submitted to 36.0 ° C presented higher fertility in vitro. Total motility, progressive motility and movement pattern were related to the in vitro production of embryos.

AVALIAÇÃO DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO E USO DE ANTIMICROBIANOS NA QUALIDADE DE DOSES SEMINAIS DE SUÍNOS

A bacteriospermia pode prejudicar a qualidade das doses de sêmen suíno. Desta forma, a adição de antimicrobianos (ATM) aos diluentes de sêmen é imprescindível para a manutenção da qualidade das doses inseminantes. Contudo, a crescente ocorrência de resistência bacteriana tem impulsionado a redução do uso de ATM na suinocultura. Nesse sentido, o armazenamento das doses inseminantes em baixas temperaturas pode ser uma alternativa para a remoção dos ATM dos diluentes comerciais. Sendo assim, no presente estudo, foram realizados dois experimentos para avaliar a qualidade espermática e a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de doses de sêmen suíno submetidas a baixas temperaturas de armazenamento, na ausência ou presença de ATM. No experimento 1, as motilidades (total e progressiva) das doses com ATM foram maiores conforme aumentou a temperatura de armazenamento (P<0,01). Nas doses sem ATM, as motilidades foram inferiores nas mantidas a 5 °C do que nas demais (P<0,05). O número de UFC/mL foi menor nas doses sem ATM mantidas a 5 e 10 °C do que a 17 °C (P<0,05), mas não houve diferença entre as temperaturas de armazenamento nas doses com ATM (P>0,05). As integridades de acrossoma e de membrana plasmática não foram afetadas (P>0,05) pelo uso de ATM, mas foram influenciadas pela temperatura de armazenamento (P<0,0001). No experimento 2, os machos foram categorizados em BONS e RUINS de acordo com a motilidade progressiva das doses com ATM armazenadas a 5 °C nas 120 h, sendo investigado o efeito dessas categorias sobre as variáveis estudadas. A motilidade total das doses armazenadas a 17 °C foi superior à das mantidas a 5 °C diluídas sem ATM (P<0,05). Os percentuais de motilidade progressiva e de acrossomas normais foram superiores nas doses mantidas a 17 °C do que nas mantidas a 5 °C, com ou sem ATM (P<0,05). O número de UFC/ml foi maior nas doses diluídas sem ATM do que nas demais (P<0,05). Após a categorização dos machos, as motilidades (total e progressiva) foram maiores nos machos BONS do que nos RUINS (P<0,05), sem diferença significativa (P>0,05) nas integridades (acrossomal e de membrana plasmática). Apesar de a qualidade espermática ter sido afetada negativamente pelas baixas temperaturas, o armazenamento das doses de sêmen suíno a 5 °C é possível, uma vez que foi mantida a viabilidade espermática in vitro, por até 5 dias, acima do nível mínimo considerado adequado para a inseminação artificial. Contudo, o uso de doses sem antimicrobianos ainda precisa de otimização, posto que que as baixas temperaturas de armazenamento reduzem, mas não inibem por completo o crescimento bacteriano.

Bacteriospermia can impair boar semen dose quality. Thus, the addition of antibiotics (ATB) is indispensable for maintaining semen doses quality. Nevertheless, growing bacterial resistance occurrence have had driven to a reduction in use of ATB in pig industry. In this sense, storage of semen doses at low temperature may be an alternative to removal ATB of commercial semen extenders. Therefore, the aim of the present study was to assess sperm quality and number of colony-forming units (CFU mL-1) in boar semen doses stored at low storage temperatures with or without ATB, in two experiments. In experiment 1, in semen doses with ATB, total and progressive motility increased as the storage temperature increased (P<0.01). In semen doses without ATB, total and progressive motility were observed to be lower when stored at 5 °C than at 10 and 17 °C (P<0.05). The number of CFU mL-1 was lower in semen doses without ATB stored at 5 and 10 °C than at 17 °C (P<0.05), but there was no difference among storage temperatures in doses with ATB (P>0.05). Acrosome and sperm membrane integrity were not influenced (P>0.05) by using ATB, but they were influenced by storage temperature (P<0,0001). In experiment 2, boars were grouped in GOOD and POOR according to progressive motility in doses stored for up to 120 h at 5 °C. So, the effect of this classification on assessed variables, was investigated. Total motility was higher in doses stored at 17 °C than in doses without ATB stored at 5 °C (P<0.05). The percentages of progressive motility and normal acrosomes were higher in doses stored at 17 °C than in doses stored at 5 °C, with or without ATB (P<0.05). The number of CFU mL-1 was higher in doses without ATB than in remaining ones (P<0.05). Total and progressive motility were observed to be higher in GOOD than in POOR boars (P<0.05). There was no difference between groups of boars in acrosome and membrane integrity (P>0.05). Despite sperm quality was negatively affected by low temperatures, the storage of boar semen doses at 5 °C is possible, since sperm viability in vitro was maintained for up to 5 days, fulfilling the requirements of semen quality to be used in artificial insemination. Nevertheless, the use of semen doses without ATB will need optimization, since low storage temperatures decreased bacterial growth, but not completely inhibit it.

INFLUÊNCIA DA SAZONALIDADE NAS CARACTERÍSTICAS REPRODUTIVAS DE CARNEIROS DE RAÇAS LEITEIRAS

TOAZZA, Rafael. Influência da sazonalidade nas características reprodutivas de carneiros de raças leiteiras. 2018, 83 p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Lages, 2018. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da sazonalidade nas características reprodutivas de carneiros de raças leiteiras. Ao longo de um ano, o sêmen de 13 carneiros Frisona Milchschaf e Lacaune tiveram o sêmen coletado mensalmente, tendo seus parâmetros reprodutivos e características seminais avaliadas. A cada estação do ano, o sêmen coletado foi congelado e descongelado, sendo avaliado quanto a motilidade, vigor, teste de termo resistência (TTR), teste hiposmótico, presença de patologias espermáticas e eficiência na fecundação in vitro (FIV) heteróloga com oócitos bovinos. A motilidade progressiva para sêmen fresco na primavera foi superior às demais estações do ano, sendo observada a pior motilidade no inverno. Já o vigor apresentou variações inconstantes ao longo das estações. Defeitos maiores e menores apresentaram variações significativas ao longo dos meses, porém em nenhum deles houve número de anormalidades que possibilitasse classificar os carneiros como inaptos para a reprodução. O perímetro escrotal foi maior durante os meses mais quentes. O inverso ocorreu com a consistência testicular, que aumentou nos meses mais frios e diminuiu nos meses mais quentes. Volume, turbilhão e concentração espermática foram muito variáveis independente do mês, mas provavelmente por efeito do regime de monta intensivo utilizado (dados não publicados). Houve uma influência sazonal na criotolerância, sendo que na avaliação após o descongelamento, observou-se que a sobrevivência do sêmen congelado no outono foi superior ao congelado no verão. Não foram observadas diferenças significativas na avaliação morfológica e na integridade de membrana, nas diferentes estações. Não houve diferença estatística na taxa de recuperação de espermatozoides após submissão ao processo de migração swim up, nem entre as taxas de clivagem após FIV heteróloga (52,6; 50,5; 46,5 e 45,5%) para verão, outono, primavera e inverno, respectivamente. Houve influência da temperatura ambiente na consistência e perímetro testicular, bem como um efeito da estação do ano na motilidade progressiva e vigor tanto no sêmen fresco como após submissão ao TTR, com maior motilidade na primavera (estação não reprodutiva) em relação ao outono (estação reprodutiva). No inverno, os carneiros apresentaram sêmen de pior qualidade. A sazonalidade influenciou a criotolerância do sêmen de carneiros leiteiros, com maior sobrevivência sendo observada no outono. Mesmo com estas influências, as taxas de clivagem semelhantes após FIV heteróloga, demonstram que é possível congelar sêmen de carneiros leiteiros em qualquer estação do ano, com boa viabilidade. Finalmente, não existe efeito sazonal em relação a morfologia nem a integridade de membrana do sêmen descongelado de carneiros de raças leiteiras.

Toazza, Rafael. The influence of seasonality on dairy rams reproductive features. 2018, 83 p. Dissertation (Master in Animal Science). Santa Catarina State University. Post Graduate Program in Animal Science. Lages, 2018. This work aimed to investigate the role played by seasonality in the reproductive features of dairy rams. Semen was collected monthly for one year from 13 rams from either Frisona Milchschaf or Lacaune breeds in order to evaluate both their reproductive parameters and seminal characteristics. Semen samples frozen at every season were later thawed for assessment of sperm motility and vigor, as well as for survival to the thermal resistance test (TRT) and to the hyposmotic test. The presence of sperm pathologies and the efficiency after heterologous in vitro fertilization (IVF) of bovine oocytes were also assessed. The progressive motility for fresh semen during spring was higher than for all the other seasons, while the lowest motility was observed in the winter, whereas the vigor had inconsistent variations over the seasons. Major and minor defects presented significant variations over the months, however none of them showed enough abnormalities to score the rams as unable for reproduction. The scrotal perimeter increased during the warmest months. The consistency had an inverse relation, increasing during the coldest months, and decreasing during the warmest months. Volume, gross motility and sperm concentration varied despite the months, and suffered a possible effect from the intense breeding regimen performed (unpublished data). There was a seasonal influence in the semen cryotolerance, with higher survival rates in autumn frozen semen, in comparison to summer frozen semen. The morphological evaluation and membrane integrity showed no significant differences over the different seasons. There were no statistically differences for sperm recovery rate after swim up, nor in the cleavage rates after heterologous IVF (52.6, 50.5, 46.5 and 45.5%) for summer, fall, spring and winter, respectively. There was an influence of the housing temperature in the testicular consistency and perimeter. There was also an effect of the season on sperm progressive motility and vigor of the fresh semen, as well as after submission to the TRT, with higher motility in the spring (non-reproductive season) in comparison to autumn (reproductive season). In the winter, semen quality was the worst. The seasonality influenced the semen cryotolerance of dairy rams, with better survival rates in autumn. Despite all these influences, the similar cleavage rates obtained after heterologous IVF demonstrate that it is possible to freeze semen from dairy rams at any season of the year, with good viability. Finally, neither sperm cell morphology nor membrane integrity showed seasonal effects on the thawed semen of dairy rams.

AVALIAÇÕES FUNCIONAIS E BIOQUÍMICAS PARA TOUROS DE ALTA FERTILIDADE

A predição da fertilidade de touros é uma área da pesquisa que tem recebido muita atenção devido a sua importância na indústria de bovinocultura de corte. Um modelo de predição de fertilidade baseado na avaliação precoce dos parâmetros da qualidade de sêmen permitiria identificar e remover indivíduos com fertilidade potencialmente baixa de programas de reprodução. Entretanto, parâmetros convencionais utilizados na avaliação espermática in vitro têm mostrado resultados limitados quanto à capacidade de predizer o potencial de fertilidade do sêmen in vivo. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar a relação entre a qualidade do sêmen in vitro e a fertilidade in vivo de touros, por meio da correlação de dados de análises bioquímicas e de cinética espermática com a taxa de prenhez. Amostras de sêmen congelado de seis touros Aberdeen Angus foram classificadas como fertilidade alta (n = 3) e baixa (n = 3). O pool de sêmen foi avaliado para a cinética de espermática (sistema computadorizado de análise espermática; CASA), produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica, atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e capacidade antioxidante total. As amostras foram avaliadas imediatamente após o descongelamento (PT); após teste de resistência térmica (TRT) a 36ºC por 3 horas; após seleção de espermática (SS) pelo gradiente de densidade de Percoll; e após SS + TRT. Os parâmetros de cinética espermática: motilidade total (MTOT, 51,29±5,60%), motilidade progressiva (MP; 36,12±5,56%) e frequência de batimentos do flagelo (BCF; 8,11±0,77 hz) foram significativamente maiores em touros de baixa fertilidade quando comparados aos touros de alta fertilidade. A velocidade curvilinear (VCL; 40,15±7,92 m/s) foi maior em touros de alta fertilidade após SS + TRT. A velocidade linear (VSL; r = -0,99), a velocidade média do percurso (VAP; r=-0,99), linearidade (LIN; r = -0,98) e BCF (r = -0,99) foram correlacionadas com alta fertilidade após SS + TRT. ROS demonstrou correlação (r=-0,98) com fertilidade após SS. Houve uma diminuição significativa dos níveis de FRAP e ROS após SS em touros de baixa e alta fertilidade (P0,05), enquanto que uma diminuição da peroxidação lipídica foi observada apenas em touros de alta fertilidade. Os resultados não mostraram diferença significativa entre touros de fertilidade baixa e alta na peroxidação lipídica. No entanto, houve uma correlação (r=-0,99) entre a peroxidação lipídica e alta fertilidade após PT e SS + TRT. Esses resultados sugerem que espermatozoides de touros de alta fertilidade são capazes de prevenir o dano induzido pelo estresse oxidativo. Os dados de cinética espermática obtidos pelo CASA demonstram que a avaliação das combinações dos parâmetros poderia predizer a fertilidade in vivo de forma mais precisa do que a avaliação individual desses parâmetros. Além disso, a separação espermática em gradiente de Percoll reduziu os níveis de estresse oxidativo, consequentemente, melhorando a qualidade espermática. O presente estudo compartilha informações uteis para o desenvolvimento futuro de modelos de predição de fertilidade em touros.

Prediction of bull fertility is an area of research that has received much attention due to its importance in the beef cattle industry. A prediction model of fertility based on early assess of semen quality parameters would allow identify and remove sires with potentially low fertility from breeding programs. However, conventional parameters used on in vitro sperm assessments have shown limited results in the ability to predict the fertility potential of semen in vivo. Therefore, the aim of the present study was to investigate the relationship between in vitro semen quality and in vivo fertility of bulls by correlating biochemical and sperm kinetics data with pregnancy rate. Frozen semen samples from six Aberdeen Angus bulls were classified as high (n=3) and low (n=3) fertility. Semen pool was evaluated to sperm kinetics (computer assisted sperm analysis; CASA), reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation, superoxide dismutase enzyme (SOD) activity and total antioxidant capacity. Samples were evaluated immediately after thawing (PT); after thermal-resistance test (TRT) at 36ºC for 3 hours; after sperm selection (SS) by Percoll density gradient; and after SS + TRT. Sperm kinetic parameters: total motility (MTOT; 51.29±5.60%), progressive motile (MP; 36.12±5.56%) and beat cross-frequency (BCF; 8.11±0.77 hz) were significantly higher in low-fertility bulls when compared to high fertility ones. Curvilinear velocity (VCL; 40.15±7.92 µm/s) was greater in high fertility bulls after SS + TRT. Straight-line velocity (VSL; r=-0.99), average path velocity (VAP; r=-0.99), linearity (LIN; r=-0.98), and BCF (r=- 0.99) were correlated to high fertility after SS + TRT. ROS showed correlation (r=-0.98) with fertility after SS. There was a significant decrease of FRAP and ROS levels following SS in both low and high fertility bulls (P0.05), whereas a decrease of lipid peroxidation was observed only in high fertility bulls. The results showed no significant difference between low and high fertility bulls in lipid peroxidation. However, there was a correlation (r=-0.99) between lipid peroxidation and high fertility after PT and SS + TRT. Sperm kinetic data obtained by CASA showed that the assessment of a combination parameters could predict in vivo fertility more accurately than the assess of an individual one. In addition, spermatic separation by the Percoll gradient reduced oxidative stress levels, hence, improving sperm quality. The present study shares useful information for the future development of fertility prediction models in bulls. Keywords: . . .

Efeito da utilização de diferentes diluidores para a produção in vitro de embriões bovinos / Effect of different bovine semen extenders on in vitro development of bovine embryos

Objetivou-se avaliar as características morfológica e funcional do sêmen bovino congelado comparando-se a eficácia de dois diferentes diluidores. O ejaculado de quatro touros foi dividido em duas partes iguais, uma submetida ao diluidor Tris e gema de ovo (A) e outra ao diluidor à base de lecitina de soja (Andromed®) (B). No experimento I, cinco palhetas dos diluidores A e B de cada touro foram descongeladas e avaliadas quanto à motilidade, vigor, concentração, morfologia espermática e teste de termor-resistência lento. Foram feitas, ainda, avaliação da integridade de membranas, por meio da associação das sondas iodeto de propídio, isotiocionato de fluoresceína - Pisum sativum e carbocianina catiônica lipofílica, e avaliação funcional da membrana plasmática com teste hiposmótico. A avaliação da integridade da cromatina foi realizada pelo método de coloração com laranja de acridina. No experimento II, o sêmen com os diferentes diluidores foi utilizado na fecundação in vitro, sendo observadas taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário in vitro. Em relação aos resultados obtidos, apenas a porcentagem de espermatozoides no sêmen congelado foi discretamente maior com o diluidor A, concluindo-se que o diluidor composto por lecitina de soja pode substituir o composto por Tris e gema de ovo, respeitando-se as variações individuais de cada touro utilizado no presente experimento.(AU)

The goal of this study was to evaluate the protective effect of egg yolk compared with a soybean lecithin-based extender on morphologic and functional characteristics of frozen bovine semen. The ejaculate of four bulls was divided into two equal parts, one diluted with egg-yolk-Tris extender (A) and the other with a soy-lecithin based extender (Andromed®) (B). In experiment I, five straws of extender A and B from each bull were thawed and assessed regarding motility (subjective and computerized analysis), vigor, concentration, sperm morphology and slow thermoresistance (STR), evaluation of membrane integrity through association of propidium iodite probes (PI), fluorescein isotiocianate - Pisum sativum (FITC-PSA) and lipophilic cationic carbocyanine (JC-1) and functional evaluation of the plasmatic membrane through Hyposmotic Swelling Test (HOST). An evaluation of chromatin integrity was performed with the acridine orange staining procedure. In experiment II, the frozen semen with different extenders was used for in vitro fertilization (IVF), analyzing cleavage rates and in vitro embryo development. No statistical difference between extenders was identified, suggesting that the soy lecithin extender may substitute egg-yolk-Tris extender, considering the individual variations of each bull used in this experiment.(AU)

Efeito da Trealose adicionada ao meio de congelamento do sêmen de cão doméstico

Os cães domésticos tem sido usados como modelo experimental de seus análogos silvestres devido às semelhanças fisiológicas reprodutivas. Para tanto, entender a fisiologia reprodutiva dos cães é essencial para criação de programas de preservação de gametas sendo a criopreservação uma ferramenta fundamental. Vários estudos, no entanto, tem demostrado que a sobrevivência do sêmen canino descongelado no trato genital da fêmea é muito reduzida. Nesse sentido, é um grande desafio aprimorar as técnicas envolvidas. Diversos produtos tem sido testados buscando reduzir os efeitos danosos do congelamento da célula espermática. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da associação da trealose no sêmen canino. Foram utilizados 5 cães machos adultos sem raça definida, os quais foram submetidos a 3 coletas a cada dois dias em cada animal totalizando em 17 coletas. Os testes in vitro aplicados às amostras de sêmen foram a avaliação da motilidade progressiva, o vigor espermático, a avaliação da integridade da membrana plasmática e do acrossoma e avaliação da longevidade espermática. O meio diluente base utilizado para a associação de crioprotetores foi o meio base TRIS Citrato com gema de ovo: (T1) (6% de glicerol, sem adição de trealose); (T2) (6% de glicerol + 2% de trealose); (T3) (6% de glicerol + 4% de trealose) e (T4) (6% de glicerol + 6% de trealose). O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25ml, resfriado a 4oC em um período de uma hora(0,57oC/min). Após essa etapa, foi feito o tempo de equilíbrio de uma hora e por fim o sêmen foi congelado. Após 24h as amostras foram descongeladas a 37oC e submetidas às mesmas análises descritas para o sêmen fresco além de serem submetidos ao teste de termo resistência (TTR). O sêmen descongelado, em todos os animais, apresentou significativamente maiores percentuais de espermatozoides com membrana plasmática lesada, em relação ao sêmen fresco, devido ao protocolo de congelamento. O vigor e a motilidade espermáticos, foram significativamente superiores com a adição da trealose ao meio, no entanto, não foi observada influencia significativa entre os diferentes níveis de trealose utilizados. O teste de termorresistência sugere que a trealose não apresenta influência positiva sobre a resistência espermática após o descongelamento. Não foi observada variação significativa (p>0,05) no percentual de defeitos maiores ou menores entre as amostras controle e iiimesmo entre as amostras adicionadas de trealose, o que significa que a morfologia espermática das amostras estudadas não foi afetada pela adição da trealose em nenhuma das concentrações nos animais estudados.

Domestic dogs have been used as experimental models of their wild dog analogs due to their reproductive physiology similarities. Therefore, it is essential to understand the reproductive physiology of the dogs to create programs for preservation of the gametes, for which cryo-preservation is an important tool. Several studies, however, have demonstrated that the survival of the defrosted canine semen on the female genital tract is reduced. For this reason, it is a great challenge to improve the techniques involved. Many products have been tested aiming to reduce the damaging effects of the spermatic cell frosting. The goal of this study was to evaluate the effect of the association of trehalose to the canine semen. 5 male adult dogs of no defined breed underwent three collecting experiments, every two days for each animal, totalizing 17 collections. The tests in vitro applied to the semen samples were: evaluation of the progressive motility, spermatic vigor, evaluation of the plasmatic membrane integrity and the acrosome, and the evaluation of the spermatic longevity. The diluent medium used for the association of the cryo-protectors was the TRIS Citrate with egg yolk: (T1) (6% of glycerol, without trehalose); (T2) (6% of glycerol + 2% of trehalose); (T3) (6% of glycerol + 4% of trehalose) and (T4) (6% of glycerol + 6% of trehalose).The semen was encased in pallets of 0,25ml, frozen at 4oC for an hour (0,57oC/min). After this phase, the sample underwent an equilibrium time of an hour and finally the semen was frosted. After 24h the samples were defrosted at 37oC and subjected to the same process described for the fresh semen and, in addition, were subjected to the term resistance test (TRT). The defrosted semen, in all animals, showed significant higher percentages of spermatozoids with damaged plasmatic membrane, in relation to the fresh semen, due to the frosting protocol. The vigor and spermatic motility were significantly higher with the addition of trehalose to the medium, however, it was not observed a significant influence among the different levels of trehalose utilized. The thermo-resistance test suggests that the trehalose does not represent positive influence over the spermatic resistance after defrosting. It was not observed a significant variation (p>0,05) of the perceptual of bigger or smaller defects among the control samples, even among the samples added with trehalose, which means that the spermatic morphology of vthe studied samples was not affected by the addition of trehalose in none of the concentration of animals studied.

Efeito de diferentes crioprotetores e aditivos no diluente sobre a qualidade seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador

Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os efeitos de diferentes crioprotetores e aditivos na criopreservação do sêmen equino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Para tanto, foram designados dois experimentos (E). No E1 objetivou-se comparar o efeito do glicerol (GLIC) e da dimetilformamida (DMFA), associados ou não, sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento, o que conferiu quatro grupos experimentais: glicerol a 5 % (GLIC), dimetilformamida a 5 % (DMFA), dimetilformamida a 3% associada ao glicerol a 2 % (DG) e o tratamento controle, composto pelo diluente comercial Botu-Crio® (BC). Já no E2 objetivou-se avaliar o efeito do congelamento de sêmen de garanhões em diluente contendo glicerol e/ou dimetilformamida, associados à antocianina (ATC) e/ou colesterol carreado por ciclodextrina (CCC). Para tanto, os ejaculados foram congelados em dez diferentes tratamentos, de acordo com as associações entre crioprotetores e aditivos. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas mediante teste de termo-resistência (TTR) e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e peroxidação lipídica da membrana plasmática; a avaliação quanto à organização da bicamada lipídica só foi realizada no E1. Os melhores resultados obtidos no TTR do E1 foram referentes aos tratamentos DMFA e DG (p<0,05), que mantiveram as maiores médias de motilidade espermática total após trinta minutos de incubação a 37 oC. O potencial mitocondrial não sofreu alteração frente aos tratamentos aplicados (p>0,05). A maior proporção de células com integridade de membrana plasmática e acrossomal foi observada nos tratamentos DMFA e BC (p<0,05). A análise de organização de membrana revelou maior desorganização no tratamento GLIC (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio no tratamento DMFA e menor proporção no tratamento GLIC x (p<0,05). Quanto à peroxidação da bicamada lipídica, não foram observadas diferenças entre os valores médios nos tratamentos (p>0,05). Em relação ao E2, não houveram interações entre crioprotetores e diluentes para maioria das características estudadas, sendo as comparações realizadas entre grupos de tratamentos. Entre os crioprotetores, o grupo DMFA apresentou os melhores resultados quanto à motilidade espermática durante o TTR, seguido do grupo DG (p<0,05) e dentre os aditivos os grupos CCC e AC foram superiores aos demais (p<0,05). Em relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, os grupos BC e GLIC apresentaram os piores resultados dentre os crioprotetores, assim como os grupos BC e ATC dentre os aditivos (p<0,05). As maiores médias obtidas quanto ao potencial mitocondrial foram referentes aos grupos DMFA e DG entre os crioprotetores, e CCC e AC entre os aditivos (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio nos grupos DMFA e DG dentre os crioprotetores, e nos grupos CCC e AC dentre os aditivos (p<0,05). Em relação à peroxidação da membrana plasmática foi observada interação entre crioprotetores e aditivos na população de células viáveis (p<0,05), de forma a revelar melhor associação da CCC à DMFA. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que os tratamentos DMFA e DG apresentaram melhores condições para manutenção da viabilidade espermática in vitro, de forma que ambos podem sem utilizados como alternativa em diluidores na criopreservação de sêmen equino. Em relação ao uso da CCC, a sua associação deve ser feita preferencialmente com a DMFA. Os resultados obtidos quanto à ação da ATC não foram satisfatórios, necessitando de novos estudos quanto à concentração ideal e seus efeitos no congelamento de sêmen de garanhões.

The aim of this study was to compare the effects of different cryoprotectants and additives in cryopreservation of Mangalarga Marchador stallions semen on sperm viability in vitro post-thaw. Thus, we designed two experiments (E). In E1 we aimed to compare the effect of glycerol and dimethylformamide, associated or not, on the sperm viability post-thawing. Therefore we collected thirty ejaculates from four stallions. Each one was divided into four treatments: 5% glycerol (GLYC), 5% dimethylformamide (DMFA), an association of 2% glycerol and 3% dimethylformamide (DG) and control treatment compound by Botu- Crio®. In E2 we aimed to evaluate the effect of stallions semen freezing in diluent containing glycerol and or dimethylformamide associated with the anthocyanin (ATC) and or cholesterol loaded cyclodextrin (CCC). We collected forty-eight ejaculates of eight stallions and each one was frozen in ten different treatments, according to the associations between cryoprotectants and additives. The samples of both experiments were evaluated by thermo- resistance test (TTR) and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential, intracellular peroxide hydrogen production, lipid peroxidation and organization of the plasma membrane bilayer (only E1). The E1 best results on the TTR were related to DMFA and DG treatments (p<0.05), who maintained the highest average total sperm motility after thirty minutes of incubation at 37 ° C. Mitochondrial potential was not affected by any group (p>0.05). The highest proportion of cells with plasma and acrosomal membrane integrity was observed in DMFA and BC treatments (p<0.05). The analysis revealed the organization of membrane disruption was greater in GLIC treatment (p<0.05). We observed a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in the treatment DMFA and a lower proportion in GLIC treatment (p<0.05). As for the peroxidation of the lipid bilayer, no differences were observed between treatments (p>0.05). About E2 there were no interactions between cryoprotectants and diluents for most traits, xiwith comparisons made between treatment groups. Among the cryoprotectants, DMFA group showed the best results on the TTR, followed by DG group (p <0.05) and among the additives CCC and AC groups were superior to the others (p <0.05). Regarding the integrity of plasma and acrosomal membrane, the BC and GLYC groups showed the worst results among cryoprotectants, as well as BC and ATC groups among the additives (p <0.05). The highest mean about mitochondrial potential were related to DMFA and DG groups among cryoprotectants, and CCC and AC between additives (p <0.05). There was a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in DMFA and DG groups from the cryoprotectants, and CCC and AC groups among the additives (p <0.05). In relation to the plasma membrane peroxidation was observed interaction between cryoprotectants and additives in the population of viable cells (p <0.05), in order to better reveal the association CCC plus DMFA. It was concluded that the DMFA and DG treatments showed better conditions for maintaining sperm viability in vitro, so both can use like alternative method for cryopreservation of stallion semen. The association with the CCC should be made preferably by with DMFA. The results related to ATC were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing stallions.

Uso do diluente água de coco em pó (ACP-103®) na conservação prolongada do sêmen do varrão: avaliação in vitro e in vivo / Use of powder coconut water as extender (ACP-103®) for boar semen longer preservation: in vitro and in vivo evaluations

O sêmen de oito reprodutores foi coletado e de cada ejaculado separou-se um total de 1,75x10(9)sptz, com concentração de 35x10(6)sptz/mL. Usou-se o Beltsville Thawing Solution (BTS) como controle para testar o diluente água de coco em pó (ACP). O dia de coleta foi o dia zero (D0), sendo o sêmen conservado durante cinco dias, com análises diárias no D0 e nos quatro dias seguintes (D1, D2, D3 e D4). A avaliação da qualidade espermática baseou-se nos resultados do vigor espermático, da porcentagem de células móveis, da morfologia espermática, da integridade da membrana plasmática e dos resultados de fertilidade. As avaliações do vigor espermático (4,1) e da porcentagem de espermatozoides móveis (91 por cento) ficaram acima dos parâmetros mínimos exigidos (3,0 e 70 por cento) para sua utilização em programas de inseminação artificial, pois não houve influência sobre as variáveis analisadas pelo protocolo experimental. O resultado médio da resistência osmótica foi de 71,3 por cento de espermatozoides com cauda enrolada. Não houve diferenças entre os dois diluentes testados para a característica células com acrossoma intacto (BTS = 67,1 por cento; ACP = 71,2 por cento). O sêmen diluído em ACP apresentou maior número de células vivas (77,7 por cento) com membrana plasmática íntegra (74,2 por cento) após a conservação. A escolha do diluente ACP é aconselhável para uso de rotina em laboratórios que trabalhem com conservação de sêmen suíno. Apesar dos bons resultados in vitro obtidos com o diluente ACP, o BTS apresentou os melhores resultados de fertilidade, 86,7 por cento e 96,7 por cento, respectivamente.(AU)

The semen of eight boars was collected and a total of 1.75x10(9) spermatozoa were separated from each ejaculate, obtaining a concentration of 35x10(6)sptz/mL. The Beltsville Thawing Solution (BTS) was used as control, being tested the powder coconut water as extender (PCW). The day of collection was considered day zero (D0), and the semen was conserved for five days, with analyses on D0 and on four subsequent days (D1, D2, D3, and D4). The evaluation of spermatic quality was based on the results of spermatozoa vigour, cells motility, spermatic morphology, plasmatic membrane integrity, and fertility. The evaluations of the in natura semen presented mean values of spermatozoa vigour (4.1) and mobile spermatozoids percentage (91 percent) above the demanded minimum parameters (3.0 and 70 percent) for its use in artificial insemination programs without influencing on the analyzed variables. The mean results of the osmotic resistance were excellent, with 71.3 percent of spermatozoids with coiled tail. There were no differences between the two extenders tested for the characteristic cells with intact acrossome (BTS = 67.1 percent; PCW = 71.2 percent). The semen diluted in PCW extender presented a higher number of alive cells (77.7 percent) with a complete plasmatic membrane (74.2 percent) after conservation period. The choice of PCW extender is advisable for the routine use in laboratories that work with conservation of swine semen. In spite of the good results in vitro with the PCW extender, the BTS presented the best fertility results, 86.7 percent and 96.7 percent, respectively.(AU)

Influência da sensibilidade individual de varrões sobre a qualidade espermática após descongelação / Influence of boar individual sensibility on spermatic quality after tawing

Diversos trabalhos têm demonstrado diferenças na qualidade espermática do sêmen descongelado entre diversos reprodutores suínos, demonstrando variações na resistência individual dos espermatozóides destes animais ao processo de congelação. Este trabalho teve por objetivo testar o sêmen proveniente de diferentes reprodutores para se identificar sensibilidades individuais ao processo de congelação. Quatro machos foram coletados, em recipiente de 500 mL coberto por gaze para separação da parte gelatinosa e protegido por envoltório térmico. Cada amostra continha 112 x106 sptz/mL para as análises in vitro. A técnica de Paquignon foi utilizada para a congelação do sêmen. Após a descongelação, a 37oC durante 30 segundos, o conteúdo de cada palheta foi ressuspenso após descongelação no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS). Foram avaliadas em microscopia óptica o vigor e a motilidade espermática após descongelação (M1), ressuspensão (M2) e 10 minutos (M3) e 2 horas de incubação (M4) a 37oC. A morfologia do acrossoma foi analisada em esfregaço de sêmen feito em M3. Foi utilizado o teste de Mann Whitney através do General Linear Models do programa Statistical Analysis System (SAS 6.03, 1988) a 5% (p<0,05).(AU)

Several works have been demonstrating differences in spermatic quality of the thawed semen among several swine males. Variations are diagnosed in the individual resistance of the spermatozoids of these animals to the freezing process. This work had for objective to test the semen from the different boars to identify individual sensibilities to the freezing process. Four males were collected, in recipient with 500 mL covered by filter for separation of the gelatinous part and protected by thermal wrapper. Each sample contained 112 x106 sptz/mL for the in vitro analyses. The Paquignon technique was used for the semen freezing. After descongelation at 37oC during 30 seconds, the content of each slat was diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS). They were analysed in optical microscopy, the vigour and the spermatic motility, after descongelation (M1), dilution (M2) , 10 minutes (M3) and 2 hours of incubation (M4) at 37oC. The acrossome morphology was analyzed in M3. The Mann Whitneys test was used with the Lineal General Models in Statistical Analysis System Program (HEALTHY 6.03, 1988) at 5% (p<0,05).(AU)

Influência da sensibilidade individual de varrões sobre a qualidade espermática após descongelação / Influence of boar individual sensibility on spermatic quality after tawing

Diversos trabalhos têm demonstrado diferenças na qualidade espermática do sêmen descongelado entre diversos reprodutores suínos, demonstrando variações na resistência individual dos espermatozóides destes animais ao processo de congelação. Este trabalho teve por objetivo testar o sêmen proveniente de diferentes reprodutores para se identificar sensibilidades individuais ao processo de congelação. Quatro machos foram coletados, em recipiente de 500 mL coberto por gaze para separação da parte gelatinosa e protegido por envoltório térmico. Cada amostra continha 112 x106 sptz/mL para as análises in vitro. A técnica de Paquignon foi utilizada para a congelação do sêmen. Após a descongelação, a 37oC durante 30 segundos, o conteúdo de cada palheta foi ressuspenso após descongelação no diluente Beltsville Thawing Solution (BTS). Foram avaliadas em microscopia óptica o vigor e a motilidade espermática após descongelação (M1), ressuspensão (M2) e 10 minutos (M3) e 2 horas de incubação (M4) a 37oC. A morfologia do acrossoma foi analisada em esfregaço de sêmen feito em M3. Foi utilizado o teste de Mann Whitney através do General Linear Models do programa Statistical Analysis System (SAS 6.03, 1988) a 5% (p<0,05).

Several works have been demonstrating differences in spermatic quality of the thawed semen among several swine males. Variations are diagnosed in the individual resistance of the spermatozoids of these animals to the freezing process. This work had for objective to test the semen from the different boars to identify individual sensibilities to the freezing process. Four males were collected, in recipient with 500 mL covered by filter for separation of the gelatinous part and protected by thermal wrapper. Each sample contained 112 x106 sptz/mL for the in vitro analyses. The Paquignon technique was used for the semen freezing. After descongelation at 37oC during 30 seconds, the content of each slat was diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS). They were analysed in optical microscopy, the vigour and the spermatic motility, after descongelation (M1), dilution (M2) , 10 minutes (M3) and 2 hours of incubation (M4) at 37oC. The acrossome morphology was analyzed in M3. The Mann Whitney’s test was used with the Lineal General Models in Statistical Analysis System Program (HEALTHY 6.03, 1988) at 5% (p<0,05).

Efeito da tensão de oxigênio e do meio na maturação oocitária in vitro e sua influência no desenvolvimento embrionário em suínos / Effect of oxygen tension and media on in vitro oocyte maturation and its influence in the porcine embryonic development

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da baixa tensão de oxigênio (5% de CO2; 5% de O2 e 90% de N2) na maturação oocitária in vitro em meio quimicamente definido (0,1% de PVA) ou suplementado com 10 % de PFF. Foram avaliados a migração dos grânulos corticais, a quantificação e distribuição da proteína HSP70, a maturação nuclear, as concentrações intracelulares da glutationa reduzida, a avaliação dos índices de penetração espermática e o desenvolvimento e qualidade de embriões fecundados in vitro em oócitos antes da maturação (0 hora) e após a maturação in vitro nos diferentes tratamentos (atmosfera = 5 ou 20% de O2 e suplementação do meio de maturação = 0,1% de PVA ou 10% de PFF). Para verificar a influência da atmosfera e da suplementação do meio no sistema de maturação foram avaliados o ciclo celular das células do cumulus, o número de células do cumulus por oócitos, as concentrações intracelulares de glutationa reduzida (GSH) das células do cumulus, as concentrações de TBARS no meio de maturação e a resistência das células do cumulus ao estresse oxidativo. Avaliações quanto às concentrações de GSH e HSP70 foram realizadas em oócitos in vivo, visando comparar a eficiência do sistema in vitro. Para a maioria dos parâmetros avaliados não houve interação entre a atmosfera e a suplementação do meio de maturação, indicando que o efeito da atmosfera independe do meio utilizado. Foi observado que em atmosfera com baixa tensão de O2 houve diminuição da concentração de glutationa nas células do cumulus, do índice de clivagem e do número total de blastômeros dos embriões e houve aumento do número de células por oócito após o período de maturação in vitro. A suplementação do meio de maturação com 0,1% de PVA diminuiu os índices de migração dos grânulos corticais, contudo não alterou os índices de penetração espermática. Os oócitos do grupo 0 hora apresentaram índices maiores de HSP70 do que cada um dos demais grupos, indicando provável diminuição dos estoques de HSP70 durante o período de maturação em todos os grupos de maturação in vitro. As células do cumulus provenientes de oócitos maturados em meio suplementado com 0,1% de PVA apresentaram maior número de células na fase S e G2/M do que o grupo 0 hora, entretanto isso não refletiu em aumento no número de células por oócito após a maturação. Este trabalho permite concluir que o uso de baixa tensão de oxigênio não melhora as condições do sistema de maturação oocitária in vitro em suínos, sendo que o efeito do uso desta atmosfera é, na maioria das variáveis avaliadas, independente do tipo de suplementação que se utiliza no meio de maturação in vitro

The aim of this study was to evaluate the efficiency of low oxygen tension (5% CO2, 5% O2 and 90% N2) on in vitro oocyte maturation using defined media (0.1% PVA) or supplemented with 10% PFF. To achieve this goal, oocytes were evaluated prior to in vitro maturation (0 hour) and after in vitro maturation on different treatments (atmosphere = 5 or 20% O2 and media supplementation = 0.1% PVA or 10% PFF) for cortical granules migration, quantification and distribution of HSP70 protein, nuclear maturation, intracellular concentrations of reduced glutathione, evaluation of sperm penetration and development and quality of in vitro-produced embryos. Furthermore, to evaluate the effects on maturation system, several factors were analyzed, such as: the cell cycle phase of cumulus cells, the number of cumulus cells per oocyte, the intracellular concentrations of reduced glutathione in cumulus cells, the concentrations of TBARS in maturation media and the resistance of cumulus cells to the oxidative stress. Some of these evaluations were performed on in vivo oocytes, aiming to analyze oocyte competence after in vitro maturation. Concerning the majority of the parameters analyzed, there were no interaction between atmosphere and the supplementation of maturation media, indicating that the effect of atmosphere is independent of the media used. It was possible to observe that low tension atmosphere of O2 decreased glutathione concentrations in cumulus cells, cleavage rate and total number of embryo blastomeres and increased the number of cells per oocyte after the period of in vitro maturation. The maturation media supplementation with 0.1% PVA decreased the migration of cortical granules; however this fact did not have effect on in vitro sperm penetration levels. The 0 hour oocytes showed higher levels of HSP70 than each one of the in vitro maturated groups, indicating decrease of this protein stock during the maturation period in all of the in vitro maturated groups. The cumulus cells originated from maturated oocytes in supplemented media with 0.1% PVA showed higher number of cells in S and G2/M phase than 0 hour group; however this fact did not reflect in increased cell numbers per oocyte after maturation. Therefore, the use of low oxygen tension does not improve the conditions of the in vitro porcine oocyte maturation system and their effect in most of the factors analyzed is not dependent on the supplementation of maturation media

Comparação de dois diluidores para o armazenamento de sêmen bovino utilizado na fecundação in vitro

O processo de criopreservação afeta a capacidade funcional dos espermatozóides, diminuindo a fertilidade. Tendo conhecimento desses danos a diluição do sêmen é necessária antes de submetê-lo ao choque térmico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sêmen bovino congelado com dois diferentes diluidores. O ejaculado de quatro touros foi dividido em duas partes iguais, uma delas submetida ao diluidor Tris e gema de ovo (A) e a outra ao diluidor à base de lecitina de soja (Andromed®) (B). Após a diluição o sêmen foi congelado e armazenado em nitrogênio líquido de acordo com os padrões pré-estabelecidos da central de inseminação artificial. No experimento I, cinco palhetas do diluidor A e B de cada touro foram descongeladas e avaliadas quanto à motilidade (análise subjetiva e computadorizada), vigor, concentração, morfologia espermática e teste de termo-resistência lento (TTL), avaliação da integridade de membranas por meio da associação das sondas Iodeto de Propídio (PI), Isotiocionato de Fluoresceína - Pisum sativum (FITC-PSA) e Carbocianina Catiônica Lipofílica (JC-1) e avaliação funcional da membrana plasmática através do teste hiposmótico (HIPO). A avaliação da integridade da cromatina foi realizada pelo método de coloração com laranja de acridina (LA). No experimento II, o sêmen congelado com os diferentes diluidores foi utilizado na fecundação in vitro (FIV), sendo observada as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário in vitro. A análise estatística foi efetuada através dos testes de Análise de Variância (ANOVA), teste de Tukey e teste de Wilcoxon. Em relação aos resultados obtidos com os experimentos I e II não foi observado diferença estatística entre os diluidores testados, concluindo-se que o diluidor composto por lecitina...

Nowadays the embryo transfer is a biotechnology widely used, however not much is know about the best place to put embryos into the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum (CL). In addition, not much is known about the morphological characteristics thorough the uterine horn and if it could improve or damage the uterine environment. The aims of this study were: to investigate the effect of the site of embryo placement (cranial, medial or caudal) into the uterine horn adjacent to the CL on pregnancy rates; to analyze the morphology from these tree portions of the both uterine horns adjacent and opposite to CL using histology and scanning electron microscopy; and establish the relation between pregnancy rates and morphofunctions characteristics to indicate the best place to transfer embryos. In this study 600 in vivo produced embryos (fresh and frozen-thawed) and 315 in vitro produced embryos were transferred to Holstein and crossbred recipients, in order. Nine crossbred heifers were slaughtered approximately seven days after estrus and the uterus were studied to analyze its morphology at the same time that the embryos have been transferred. The results showed that the site of embryo placement did not influence (P>0.05) the pregnancy rates in recipients receiving fresh embryos during summertime. During the winter, the pregnancy rates were greater (P<0.05) for fresh embryos transferred into the caudal portion of the uterus horn than cranial portion. For animals that received in vitro produced embryo, the site of embryo placement did not interfere (P>0.05) in the pregnancy rates. Morphophological characteristics observed by histology and scanning electron microscopy was similar in all parts of the uterine horn ipsilateral to the CL studied. However, the average number of blood vessels counted was lower in the contralateral uterine...

Influência da distrofia muscular do Golden Retriever (GRMD) na viabilidade espermática e nas características morfológicas do aparelho reprodutivo masculino / Influence of Golden Retriever muscular dystrophy (GRMD) on sperm viability and on morphologic characteristics of the male reproductive tract

As distrofias musculares constituem um grupo de doenças caracterizadas por degeneração progressiva e irreversível da musculatura. A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia letal causada pela deficiência da distrofina, proteína integrante do citoesqueleto muscular, cujo gene possui característica recessiva e localiza-se na porção p21 do cromossomo X. Avanços nos cuidados terapêuticos dos pacientes afetados pela DMD têm aumentado a expectativa e qualidade de vida dos mesmos. Por este motivo, questões de ordem fisiológica e/ou ética, antes não pensadas, dentre elas possibilidades reprodutivas destes pacientes, começaram a ser discutidas. Os modelos animais são muito úteis para se traçar paralelos entre achados morfológicos, fisiológicos, prognósticos e tratamentos de determinadas doenças que acometem o homem. A Distrofia Muscular do Golden Retriever (GRMD) é uma doença que naturalmente acomete esta raça, podendo ser um ótimo modelo animal para estudos da DMD, pois apresenta fisiopatologia semelhante. O objetivo deste estudo foi investigar a existência de possíveis alterações morfológicas do trato reprodutivo masculino e relacioná-las com o quadro espermático destes cães. Para tanto foram utilizados 5 cães com GRMD e 4 cães sadios, tendo sido realizadas ao todo 37 colheitas de sêmen, a intervalos aproximados de 30 dias entre elas. Após espermiograma de rotina, o sêmen foi avaliado quanto à integridade da membrana acrossomal (FITC-PSA), à atividade mitocondrial (JC-1) e à estrutura da cromatina (SCSA) utilizando-se a técnica da citometria de fluxo e quanto à resistência ao estresse oxidativo pela dosagem de TBARS. Fragmentos de testículo, epidídimo e próstata de cinco animais com GRMD e de 1 animal sadio foram coletados para avaliação histológica. As avaliações seminais não demonstraram diferença significativa (p>0,05) entre os grupos afetado e controle, embora as avaliações histológicas tenham mostrado alterações significativas em todos os tecidos analisados. Isto sugere que ejaculados de homens com DMD podem ser obtidos com estimulação apropriada e, utilizando técnicas de fecundação in vitro, combinada com diagnóstico genético pré-implantacional de desordem genética para um único gene, podem satisfazer o desejo de paternidade de pacientes portadores de DMD, com o nascimento de crianças não afetadas

Muscular dystrophies constitute a group of diseases characterized by progressive and irreversible muscle degeneration. Duchenne´s Muscular Dystrophy (DMD) is a lethal myopathy caused by dystrophin deficiency, a muscular cell cytoskeleton protein. The dystrophin gene have recessive characteristic and is located in the p21 portion of the X chromosome. Advancements in the therapeutic cares of the affected by the DMD have been increasing their life expectancy and quality. For this motive, physiologic and/or ethics questions, like reproductive means of these patients, began to be discussed. Animal models are very useful in drawing parallels between morphologic and physiologic findings, predictions and treatments of diseases that affect man. The Golden Retrievers Muscular Dystrophy (GRMD) is a natural disease of this race, being the best animal model for DMD studies, since it presents similar physiopathology. The aim of this study was to investigate the existence of possible morphological alterations of the male reproductive tract and their connection with the sperm qualities of these dogs. For so, thirty seven ejaculates from 5 GRMD affected dogs and 4 non-affected Golden Retrievers were collected monthly and evaluated in five different replicates. After routine spermogram, the acrosome integrity (FITC-PSA), the mitochondrial activity (JC-1) and the DNA structure (SCSA) were evaluated by flow cytometry technique. The resistance to the oxidative stress was measured by the TBARS dosage. Fragments of testicle and epididymis of five GRMD affected animals and 1 healthy animal were collected for histological evaluation. No significant difference were found in seminal evaluations (p> 0,05) between affected and control groups, though significant alterations have been seen in the histological evaluations of all the analyzed cloths. This animal model suggests that ejaculates of DMD men can be obtained by the proper stimulation, and that the conventional in vitro fertilization techniques combined with pre-implantation genetic diagnosis for single gene disorders may be efficient to satisfy the desire of paternity of DMD patients with the birth of non-affected children