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1.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213946

Resumo

As junções do tipo GAP, formadas por proteínas denominadas conexinas (Cx), são junções comunicantes responsáveis pelo fluxo intercelular de moléculas e íons, desempenhando importante funções no controle da homeostasia tecidual. Ainda, participam no controle da proliferação celular, apoptose e de diversos mecanismos envolvidos na carcinogênese em diferentes tecidos. Nas neoplasias mamárias em humanos e cães, a Cx43 apresenta funções contraditórias, dependendo da fase do desenvolvimento tumoral. Considerando a importância da Cx43 nos processos de carcinogênese e os dados contraditórios sobre sua expressão em tumores mamários, este trabalho teve como principal objetivo avaliar a imunoexpressão da Cx43 nos carcinomas mamários em felinos, correlacionando-a com os dados clínico-patológicos e de sobrevida destes animais. Neste estudo, foram incluídas amostras tumorais de 23 gatas diagnosticadas com carcinomas mamários, as quais foram submetidas a análises histopatológicas e imuno-histoquímicas para detecção de marcadores moleculares e imunoexpressão da Cx43. Os parâmetros clinico-patológicos foram correlacionados com a sobrevida pelo teste de Log-rank (P<0,05). A presença de metástase à distância e a realização de mastectomia unilateral correlacionaram-se a uma menor sobrevida nestes animais. A maioria dos carcinomas mamários (78,3%) apresentou baixa imunoexpressão da Cx43, porém sem correlação com a sobrevida. Os tumores com maior graduação histológica, assim com os subtipos histológicos e moleculares mais agressivos, apresentaram maior expressão da Cx43 quando comparados aos demais subtipos. Estes dados indicam uma correlação da Cx43 com o grau de malignidade tumoral, sugerindo sua participação na progressão dos carcinomas mamários em felinos.


The GAP junctions, are formed by proteins called connexins (Cx), are communicating junctions responsible for the intercellular flow of molecules and ions, performing important functions in the control of tissue homeostasis. They also participate in the control of cell proliferation, apoptosis and various mechanisms involved in carcinogenesis in different tissues. In human and dog mammary neoplasms, Cx43 has contradictory functions, depending on the stage of tumor development. Considering the importance of Cx43 in carcinogenesis processes and contradictory data on its expression in mammary tumors, this study aimed to evaluate the immunoexpression of Cx43 in feline mammary carcinomas, correlating it with clinical and pathological survival data. animals. In this study, tumor samples from 23 cats diagnosed with mammary carcinomas were included and submitted to histopathological and immunohistochemical analyzes to detect molecular markers and immunoexpression of Cx43. Clinical-pathological parameters were correlated with survival by the Log-rank test (P <0.05). The presence of distant metastasis and unilateral mastectomy were correlated with lower survival in these animals. Most breast carcinomas (78.3%) presented low immunoexpression of Cx43, but without correlation with survival. The tumors with higher histological grading, as well as the more aggressive histological and molecular subtypes, presented higher expression of Cx43 when compared to the other subtypes. These data indicate a correlation of Cx43 with the degree of tumor malignancy, suggesting its participation in the progression of feline mammary carcinomas.

2.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216728

Resumo

As conexinas, proteínas formadoras de junções gap, são fortemente implicadas na manutenção da homeostase tecidual devido à importante função de comunicação intercelular. As panexinas, proteínas formadoras de hemicanais, foram descobertas a pouco mais de uma década e não têm seu papel bem compreendido. São descritas diversas alterações nas conexinas durante o processo da carcinogênese e relaciona-se a panexina1 ao processo oncogênico. Considera-se a diminuição da expressão das conexinas ou a deficiência na sua capacidade de comunicação intercelular como o evento mais comumente associado às neoplasias. Além disso, pode ocorrer a localização citoplasmática incomum destas proteínas em células cancerosas. As conexinas 26, 32 e 43 podem ser observadas em glândulas mamárias de roedores e humanos, mas durante processos neoplásicos a expressão destas proteínas pode variar. Neoplasias mamárias são o segundo tipo de câncer mais freqüente em cadelas e são responsáveis por 50% dos casos malignos. Neste contexto, objetivou-se identificar a presença de panexina 1 em tecido mamário hígido e neoplásico de cadelas e identificar a presença de Cx26, 32 e 43 e panexina 1 em linhagens de células mamárias canina e humana. Para tanto, foram realizadas as técnicas de imunofluorescência indireta em tecido mamário hígido e neoplásico de cadelas e em linhagens de células mamárias canina e humana, além de avaliação através de microscopia confocal nestes materiais. Obteve-se diferentes padrões de marcação das Cxs 26, 32 e 43 e da Px1 em linhagens de células mamárias hígida e tumoral canina e humana. A expressão das Cxs 26, 32 e 43 e da Px1 nestas linhagens mostrou distribuição nuclear, citoplasmática e de membrana celular. Novos estudos são necessários para confirmar e ampliar os achados deste trabalho.


Connexins, gap junction forming proteins, are strongly implicated in the maintenance of tissue homeostasis due to their important intercellular communication function. The panexins, hemicysmal-forming proteins, were discovered within a little over a decade and have their role not well understood. It has been described changes in connexins during the carcinogenesis process and related panexin 1 to the oncogenic process. The decrease in the expression of the connexins or the deficiency in their capacity of intercellular communication is considered as the event most commonly associated with the neoplasias. In addition, inusual cytoplasmic localization of these proteins can occur in cancer cells. Connexins 26, 32 and 43 may be observed in mammary glands of rodents and humans, but during neoplastic processes the expression of these proteins may vary. Breast neoplasms are the second most frequent type of cancer in bitches and account for 50% of malignant cases. In this context, the objective was to identify the presence of panexin 1 in healthy and neoplastic breast tissue of bitches and to identify the presence of connexins 26, 32 and 43 and panexin 1 in canine and human mammary cell lines. Indirect immunofluorescence in healthy and neoplastic mammary tissue of bitches and in canine and human mammary cell lines were performed, as well as evaluation by confocal microscopy in these materials was done. Different marking patterns of Cxs 26, 32 and 43 and of Px1 were obtained in healthy and canine mammary and human breast cell lines. The expression of Cxs 26, 32 and 43 and Px1 in these lines showed nuclear, cytoplasmic and cell membrane distribution. Further studies are needed to confirm and amplify the findings of this work.

3.
Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-216615

Resumo

Embora as junções comunicantes, formadas por conexinas, tenham sido historicamente consideradas como protetoras da fisiologia tecidual, os hemicanais de conexinas e os canais de panexinas têm ganho considerável atenção como sinalizadores de processos patológicos, incluindo morte celular e inflamação. O objetivo desta tese foi investigar o papel destes dois tipos de canais, em particular os hemicanais constituídos por conexina32 (Cx32) ou conexina43 (Cx43), bem como os canais formados por panexina1 (Panx1), na doença hepática crônica. O foco foi direcionado à fibrose hepática, que é caracterizada pela formação de cicatrizes em resposta ao dano hepático, estresse oxidativo e inflamação associados à diversos tipos de doenças hepáticas crônicas. Inicialmente, verificou-se que a administração de um inibidor específico dos hemicanais de Cx43 ou um inibidor geral dos canais de conexinas em camundongos com fibrose hepática reduziu o estresse oxidativo e a inflamação no fígado, respectivamente. Adicionalmente, ambos os tratamentos aliviaram a fibrose hepática, ressaltando o envolvimento dos hemicanais de Cx43 na doença hepática crônica. Depois, a ablação genética da Cx32 revelou maior formação de cicatriz, dano hepático e estresse oxidativo em um modelo murino de fibrose hepática, apontando para um papel protetor da sinalização via Cx32 na fibrose hepática. Por fim, a ablação genética de Panx1 em dois modelos murinos de fibrose hepática mostrou resultados diferentes em relação à formação de cicatriz, danos hepáticos e inflamação, sugerindo que o envolvimento da Panx1 na fibrogênese hepática é dependente da etiologia. Coletivamente, os resultados destes estudos confirmam o papel patológico da sinalização via hemicanais de conexina e canais de panexina, e abre novas perspectivas para o tratamento clínico da fibrose hepática.


While connexin-based gap junctions have been historically considered as goal keepers of tissue physiology, connexin hemichannels and pannexin channels have lately gained considerable attention as drivers of pathological processes, including cell death and inflammation. The objective of this doctoral thesis project was to investigate the role of the latter 2 channel types, in particular hemichannels consisting of connexin32 (Cx32) and connexin43 (Cx43) as well as pannexin channels built up by pannexin1 (Panx1), in chronic liver disease. Focus was hereby put on liver fibrosis, which is characterized by scar formation in response to liver damage, oxidative stress and inflammation associated with several types of chronic liver disease. Firstly, it was found that administration of a specific Cx43 hemichannel inhibitor or a general connexin-based channel inhibitor to mice with liver fibrosis reduced hepatic oxidative stress and inflammation, respectively. In addition, both treatments alleviated liver fibrosis, thus underscoring the involvement of Cx43 hemichannels in chronic liver disease. After, genetic ablation of Cx32 in mice revealed enhanced scar formation, liver damage and oxidative stress in a mouse model of liver fibrosis, pointing to a protective role for Cx32 signaling in liver fibrosis. Finally, genetic ablation of Panx1 in 2 mouse models of liver fibrosis showed a different outcome with respect to scar formation, liver damage and inflammation, suggesting that the involvement of Panx1 in liver fibrogenesis is etiology-dependent. Collectively, the outcome of these studies confirms the pathological role of connexin hemichannel and pannexin channel signaling and opens new perspectives for the clinical treatment of liver fibrosis.

4.
Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-216377

Resumo

Embora as junções gap formadas por conexinas tenham sido consideradas, historicamente, como mantenedoras da fisiologia tecidual, recentemente os hemicanais de conexinas e os canais de panexinas ganharam atenção considerável como sinalizadores de processos patológicos, incluindo morte celular e inflamação. O objetivo desta tese de doutoramento foi investigar o papel dos dois últimos tipos de canais, em particular dos hemicanais formados por conexina32 (Cx32) ou conexina43 (Cx43), bem como dos canais de panexina, constituídos por panexina1 (Panx1), na esteatohepatite não-alcoólica (ENA). Esta doença hepática crônica é altamente prevalente em todo o mundo e é caracterizada pelo acúmulo hepatocelular de lipídios, estresse oxidativo e inflamação. Em um primeiro estudo, descobriu-se que a ENA induzida por dieta em camundongos knockout para Cx32 resulta em dano hepático, inflamação e estresse oxidativo mais pronunciados, sugerindo assim, um efeito protetor da sinalização global via Cx32. Um segundo estudo mostrou que a inibição farmacológica específica dos hemicanais de Cx32 e Cx43 alivia a manifestação clínica da ENA em camundongos, como evidenciado pela redução da inflamação e estresse oxidativo no fígado. O terceiro estudo demonstrou redução do dano hepático, inflamação e estresse oxidativo em camundongos knockout para Panx1 após indução da ENA por dieta. Coletivamente, os resultados desses estudos confirmam o papel patológico reivindicado pela sinalização via hemicanais de conexina e canais de panexina, e abre novas perspectivas para o tratamento clínico da ENA.


While connexin-based gap junctions have been historically considered as goal keepers of tissue physiology, connexin hemichannels and pannexin channels have lately gained considerable attention as drivers of pathological processes, including cell death and inflammation. The objective of this doctoral thesis project was to investigate the role of the latter 2 channel types, in particular hemichannels consisting of connexin32 (Cx32) and connexin43 (Cx43) as well as pannexin channels built up by pannexin1 (Panx1), in liver disease. Focus was hereby put on nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which is a highly prevalent type of chronic liver disease worldwide and that is characterized by hepatocellular lipid accumulation, oxidative stress and inflammation. In a first study, it was found that diet-induced NASH in whole body Cx32-/- mice results in more pronounced liver damage, inflammation and oxidative stress, thus suggesting a protective effect of overall Cx32 signaling. A second study showed that specific pharmacological inhibition of Cx32 and Cx43 hemichannels alleviates the clinical manifestation of NASH in mice as evidenced by reduced liver inflammation and oxidative stress. The third study demonstrated reduced liver damage, inflammation and oxidative stress in whole body Panx1-/- mice upon dietbased induction of NASH. Collectively, the outcome of these studies confirms the claimed pathological role of connexin hemichannel and pannexin channel signaling, and opens new perspectives for the clinical treatment of NASH.

5.
Braz. j. vet. pathol ; 5(3): 120-127, nov. 2012. ilus, tab, graf
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1397847

Resumo

Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, allowing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and regeneration/repair after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed upon Tumour Necrosis Factor alpha (TNFα), Transforming Growth Factor beta 1 (TGFß1), Metalloproteinase 3 (MMP3), Metalloproteinase 9 (MMP9) and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1 (TIMP1) genes. Results indicate varying differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days post injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular, inflammatory and regenerative/repair signalling in the CNS.(AU)


Assuntos
Animais , Camundongos , Doenças Desmielinizantes/genética , Deleção de Genes , Etídio/farmacologia , Proteínas de Transporte/química , Conexinas/toxicidade
6.
Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-208285

Resumo

A homeostase tecidual é controlada por uma série de mecanismos de comunicação. Ao nível intercelular, as junções gap permitem o tráfego de mensageiros pequenos e hidrofílicos, menores do que 1.5 kilodalton, entre duas células adjacentes. As junções gap são formadas por dois hemicanais, que por sua vez são compostos por seis proteínas denominadas conexinas (Cx). No fígado, os hepatócitos produzem principalmente Cx32, enquanto as células hepáticas não parenquimatosas contem predominantemente Cx43. As junções gap hepáticas são conhecidas por serem essenciais em diversas funções específicas do fígado, tais como secreção de albumina e metabolismo de xenobióticos. Na última década, tem-se tornado claro que os hemicanais de conexinas não são apenas precursores das junções gap, mas eles também podem participar da via de comunicação, contudo entre o citoplasma de células individuais e seus ambientes extracelulares. Além disso, foi descrita uma nova classe de proteínas semelhantes às conexinas, as panexinas (Panx), das quais a Panx1 é expressa no fígado. As pannexins se reúnem em uma configuração que lembra os hemicanais de conexinas e também participam da sinalização extracelular. Acredita-se que tanto os hemicanais de conexinas como os canais de pannexinas se tornam ativados preferencialmente em condições patológicas e, deste modo, promovam a morte celular e inflamação. O presente projeto de doutorado foi estabelecido para verificar se esta hipótese também é verdadeira nas doenças hepáticas, em particular na insuficiência hepática aguda. Inicialmente, o padrão de expressão das conexinas hepáticas foi totalmente caracterizado em um modelo murino de insuficiência hepática aguda induzida pelo paracetamol (APAP). Isto revelou uma mudança da Cx32 para Cx43 após a hepatotoxicidade induzida por APAP, com expressão de novo de Cx43 nos hepatócitos. Subsequentemente, a relevância funcional da expressão aumentada de Cx43 na insuficiência hepática aguda foi testada utilizando camundongos deficientes em Cx43. Verificou-se que a Cx43 tem um efeito protetor, uma vez que a lesão hepática induzida por APAP se agravou após a ablação genética da Cx43. Em paralelo, foi realizado um estudo semelhante utilizando camundongos knockout para Cx32, não mostrando diferenças significativas na extensão da hepatotoxicidade induzida pelo APAP em comparação aos animais selvagens. Uma vez que os animais deficientes em conexina não permitem diferenciar entre a comunicação via junções gap e a sinalização pelos hemicanais de conexina, uma série de experimentos seguintes baseou-se na utilização de inibidores dos hemicanais de Cx32 e Cx43, chamados de TAT-Gap24 e TAT-Gap19, respectivamente. Após os testes in vitro quanto a sua especificidade e eficiência in vitro, ambos os peptídeos foram administrados em camundongos com overdose pelo APAP. Enquanto TAT-Gap24 reduziu claramente a morte celular e inflamação, TAT-Gap19 apresentou apenas efeitos discretos sobre a lesão hepática. Além disso, o co-tratamento 12 de camundongos intoxicados pelo APAP com ambos os peptídeos revelou um efeito aditivo na redução da lesão hepática. Um estudo final foi focado na elucidação da expressão hepática e função da Panx1 na hepatotoxicidade induzida pelo APAP, utilizando o peptídeo inibidor da Panx1, 10Panx1. Verificou-se que a inibição dos canais de Panx1 minimiza as características clínicas da hepatotoxicidade desencadeada pelo APAP, em particular a relacionada com morte celular e inflamação. Em geral, este projeto de doutorado demonstra, pela primeira vez, o envolvimento dos hemicanais de conexina e canais de pannexina na insuficiência hepática aguda induzida pelo APAP, o que sugere um papel como alvos terapêuticos para fármacos.


Tissue homeostasis is controlled by a plethora of communication mechanisms. At the intercellular level, gap junctions allow the trafficking of small and hydrophilic messengers of less than 1.5 kilodalton between two adjacent cells. Gap junctions are built up by two hemichannels, which in turn are composed of six connexin (Cx) proteins. In liver, hepatocytes mainly produce Cx32, while non-parenchymal hepatic cells predominantly harbor Cx43. Hepatic gap junctions are known to underlie several liver-specific functions, such as albumin secretion and xenobiotic metabolism. In the last decade, it has become clear that the connexin hemichannels are not only precursors of gap junctions, but that they can also provide a communication pathway, albeit between the cytosol of individual cells and their extracellular environment. In addition, a novel class of connexin-like proteins has been identified, the pannexins (Panx), of which Panx1 is expressed in the liver. Pannexins gather in a configuration reminiscent of connexin hemichannels and also support extracellular signaling. Both connexin hemichannels and pannexin channels are believed to become preferably activated in pathological conditions and thereby to promote cell death and inflammation. The present doctoral project was set up to verify the hypothesis that this also holds true for liver disease, in particular acute liver failure. In a first instance, the hepatic connexin expression pattern was fully characterized in a mouse model of acute liver failure induced by acetaminophen (APAP). This revealed a switch from Cx32-to-Cx43 upon APAP-induced hepatotoxicity with de novo expression of Cx43 in hepatocytes. Subsequently, the functional relevance of enhanced Cx43 expression in acute liver failure was tested using Cx43-deficient mice. It was found that Cx43 has a protective effect, since liver APAP-induced injury became aggravated upon genetic ablation of Cx43. In parallel, a similar study was set up using Cx32 knock-out mice, showing no major differences in the extent of APAP-induced hepatotoxicity compared to wild type animals. Since connexin-deficient animals do not allow to discriminate between gap junction communication and connexin hemichannel signaling, a next set of experiments relied on the use of claimed peptide-based inhibitors of Cx32 and Cx43 hemichannels, namely TAT-Gap24 and TAT-Gap19, respectively. Following testing of their specificity and efficiency in vitro, both peptides were administered to APAPoverdosed mice. While TAT-Gap24 clearly reduced liver cell death and inflammation, TAT-Gap19 only had marginal effects on liver injury. Furthermore, co-treatment of APAPintoxicated mice with both peptides revealed an additive effect in lowering liver injury. A final study was focused on elucidating the hepatic expression and role of Panx1 in APAPinduced hepatotoxicity using the Panx1 inhibiting peptide 10Panx1. It was found that inhibition of Panx1 channels counteracts the clinical features of APAP-triggered hepatotoxicity, in particular related to cell death and inflammation. Overall, this doctoral 10 project shows for the first time the involvement of connexin hemichannels and pannexin channels in APAP-induced acute liver failure, which suggests a role as therapeutic drug targets.

7.
Braz. j. vet. pathol ; 3(1): 46-51, may 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1469819

Resumo

Connexin (Cx) expression is reportedly altered in neoplasms. This study aimed to investigate the expression of Cx43, 26 and 32 in normal and pathological canine perianal glands. Thirty perianal glands bearing pathological processes and ten normal canine perianal glands were submitted to immunohistochemistry to search for presence of Cx43, Cx26 and Cx32. Both Cx43 and Cx26 expressions were observed in normal, hyperplastic glands, and in well and moderately differentiated adenomas. However, in poorly differentiated adenomas, expressions were reduced, and they were absent in carcinomas. Cx26 was located in the cytoplasm of normal, hyperplastic perianal gland cells, and in well and moderately differentiated adenomas. Cx32 was not observed in any neoplasm neither in normal or hyperplastic glands. Our results show that Cx43 and Cx26 expressions are altered in more aggressive canine perianal gland neoplasms, and we conclude that they may be related to the perianal gland carcinogenesis process


Assuntos
Animais , /análise , Conexinas/análise , Conexinas/imunologia , Neoplasias das Glândulas Anais/diagnóstico , Neoplasias das Glândulas Anais/microbiologia , Sinapses Elétricas/patologia
8.
Braz. J. Vet. Pathol. ; 3(1): 46-51, may 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-2546

Resumo

Connexin (Cx) expression is reportedly altered in neoplasms. This study aimed to investigate the expression of Cx43, 26 and 32 in normal and pathological canine perianal glands. Thirty perianal glands bearing pathological processes and ten normal canine perianal glands were submitted to immunohistochemistry to search for presence of Cx43, Cx26 and Cx32. Both Cx43 and Cx26 expressions were observed in normal, hyperplastic glands, and in well and moderately differentiated adenomas. However, in poorly differentiated adenomas, expressions were reduced, and they were absent in carcinomas. Cx26 was located in the cytoplasm of normal, hyperplastic perianal gland cells, and in well and moderately differentiated adenomas. Cx32 was not observed in any neoplasm neither in normal or hyperplastic glands. Our results show that Cx43 and Cx26 expressions are altered in more aggressive canine perianal gland neoplasms, and we conclude that they may be related to the perianal gland carcinogenesis process (AU)


Assuntos
Animais , Neoplasias das Glândulas Anais/diagnóstico , Neoplasias das Glândulas Anais/microbiologia , Conexina 43/análise , Conexinas/análise , Conexinas/imunologia , Sinapses Elétricas/patologia
9.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202936

Resumo

As conexinas são proteínas essenciais e estão diretamente relacionadas à propagação do impulso elétrico no coração, à velocidade de condução bem como à gênese de muitas afecções cardíacas. Em face da circulação extracorpórea (CEC) ainda ser utilizada de forma inconsistente na medicina veterinária e devido aos poucos estudos observados na literatura sobre os efeitos provocados pelo emprego da CEC na expressão da conexina 43 (Cx43) no miocárdio, objetivou-se avaliá-la em 15 animais da espécie canina, distribuidos em três grupos (C, CEC-1 e CEC -2) sendo, respectivamente, antes de realizada a CEC, com 60 minutos após esta e 60 minutos de CEC seguida de 30 minutos de restauração da perfusão espontânea. Avaliou-se a Cx43 pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e RT-PCR em tempo real no tecido muscular cardíaco de regiões correspondentes aos átrios direito (AD) e esquerdo (AE), ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) e septo transverso. Os resultados indicaram a presença da Cx43 em todas as regiões do miocárdio nos grupos C, CEC-1 e CEC-2. A expressão da Cx43 variou significativamente em CEC-2 no AE e VD em relação ao grupo C (p<0,05). A expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43) não apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. Em CEC-2 identificou-se a presença de vacuolização na túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio. Concluiu-se também que a canulação da aorta bem como a instalação do circuito de CEC no modo aorto-bicaval constitui técnica exequível.


Connexins are essential proteins that are directly associated with electrical impulse propagation and speed of propagation in the heart. They also play a major role in numerous heart conditions. The use of cardiopulmonary bypass (CPB) in veterinary medicine is inconsistent and few studies describe the effect of cardiopulmonary bypass on the expression of connexin 43 (Cx43) in the myocardium. The objective of this study was to evaluate myocardial expression of Cx43. Connexin 43 of 15 dogs was assessed at 3 moments: prior to CPB (Group C); 60 minutes after CPB (Group CPB1); and 60 minutes after CPB followed by 30 minutes of spontaneous perfusion (Group CPB2). Assessment of Cx43 included immunofluorescence, western blot and RT-PCR real time of heart tissue samples from the right atrium (RA), left atrium (LA), right ventricle (LV), right ventricle (RV) and transverse septum. Our results showed the presence of Cx43 in all 5 areas of the myocardium in groups C, CPB1 and CPB2. A significant variation on the expression of Cx43 was observed when CPB2 LA and CPB2 RV were compared to group C (p<0,05). Expression of Gja1 (gene for Cx43) did not vary significantly among the study groups. Group CBP2 presented vacuolation of the tunica media of small myocardial arteries. We conclude that cannulation of the aorta and aorto-bicaval setup of the CPB circuit is feasible technique.

10.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204483

Resumo

Alguns estudos têm mostrado que crioinjúrias observadas durante a vitrificação levam à perda da integridade de proteínas membranárias que constituem as comunicações intercelulares. Dentre as proteínas de membranas que formam essas comunicações, destacam-se as conexinas 37 (Cx37) e 43 (Cx43), as quais são importantes na interação entre oócito e células foliculares. Este estudo teve como principal objetivo avaliar o efeito da vitrificação do tecido ovariano ovino utilizando o ovarian tissue cryosystem (OTC), associado ao cultivo in vitro de folículos secundários isolados, sobre o padrão de expressão gênica e protéica das Cx37 e Cx43. Para isso, seis diferentes tratamentos foram avaliados: 1) tecido ovariano fresco (FOT); 2) tecido ovariano vitrificado (VOT); 3) folículos secundários frescos isolados de tecido ovariano fresco (FIF); 4) folículos secundários cultivados in vitro, isolados do tecido ovariano fresco (CIF); 5) folículos secundários isolados do tecido ovariano vitrificado (VIF) e 6) folículos secundários cultivados in vitro, isolados de tecido ovariano vitrificado (CVIF). O tecido ovariano fresco ou vitrificado, bem como os folículos isolados de todos os tratamentos foram avaliados quanto à expressão gênica e protéica para as Cx37 e Cx43. Adicionalmente, folículos secundários foram analisados para a integridade e crescimento folicular, morte por apoptose e proliferação celular, e folículos secundários somente cultivados in vitro (CIF e CVIF) foram avaliados para morfologia (folículos extrusos), formação de antro e viabilidade. O percentual de folículos intactos no tratamento CVIF foi significativamente superior (P < 0,05), enquanto que a formação de antro, taxa de extrusão e viabilidade folicular foram inferiores (P < 0,05) aos folículos do tratamento CIF. O teste TUNEL mostrou que folículos frescos (FIF) não apresentaram apoptose, enquanto os folículos nos demais tratamentos (CIF, VIF e CVIF) mostraram marcação positiva. A proliferação celular nos tratamentos VIF e CVIF foi mais intensa do que nos folículos do FIF. Em relação à expressão gênica, nos folículos secundários apenas a Cx43 apresentou alterações nos níveis de expressão de mRNA, sendo que os folículos do tratamento CVIF apresentaram níveis de RNAm significativamente inferiores, comparados aos folículos dos demais tratamentos. A Cx37 e Cx43 foram predominantemente imunolocalizadas nas células da granulosa e oócitos, respectivamente. Em conclusão, folículos secundários ovinos podem ser isolados com sucesso após a vitrificação do tecido ovariano e são capazes de manter a integridade da membrana após o cultivo in vitro. Embora a expressão gênica e protéica da Cx37 não varie após a vitrificação do tecido ovariano, a Cx43 é alterada nos folículos secundários após vitrificação e cultivo in vitro.


Previous studies have demonstrated that cryoinjuries showed through vitrification leads to a loss of integrity of membrane proteins that constitutes the intercellular communications. Among these membrane proteins, it is prominent the role of connexins 37 (Cx 37) and 43 (Cx 43). Thus, this study aimed evaluate the effect of vitrification of ovine ovarian tissue using ovarian tissue cryosystem (OTC), associated to in vitro culture of isolated secondary follicles, under genetic and protein expression pattern of Cx 37 and Cx 43. Ovarian fragments were distributed into six different treatments: 1) fresh ovarian tissue (FOT); 2) vitrified ovarian tissue (VOT); 3) isolated secondary follicles of fresh ovarian tissue (FIF); 4) secondary follicles cultured in vitro, follow by isolation of ovarian tissue (CIF); 5) isolated secondary follicles of vitrified ovarian tissue (VIF) and 6) secondary follicles cultured in vitro, and then isolated of vitrified ovarian tissue (CVIF). Fresh or vitrified ovarian tissue as well as isolated follicles of all treatments were evaluated to genetic and protein expression for Cx 37 and Cx 43. Additionally, secondary follicles were analyzed to integrity, follicular growth, apoptosis, and cell proliferation, while only cultured secondary follicles (CIF and CVIF) were evaluated by morphology (extruded follicles), antrum formation and viability. The percentage of intact follicles on CVIF treatment had higher (P < 0.05) while antrum formation, extruded rate and follicle viability were lower (P < 0.05) to follicles on treatment CIF. TUNEL assay demonstrates that in fresh follicles (FIF) did not show apoptosis, while follicles from other treatments had a positive labelling. A cell proliferation on VIF and CVIF treatments had more intensity of follicles from FIF. In relation to genetic expression on secondary follicles, only Cx43 alters mRNA levels, and follicles of CVIF treatment had lower (P < 0.05) mRNA levels when compared to follicles of other treatments. Cx37 and Cx43 had an immunolabelling mainly on granulosa cells and oocytes, respectively. In conclusion, the isolation of ovine secondary follicles occurs successfully after vitrification of ovarian tissue and be able to maintain the integrity of membrane after in vitro culture. Although the genetic and protein expression of Cx37 did not varies after vitrification of ovarian tissue, Cx 43 is altered on secondary follicles after vitrification and in vitro culture. Keywords:

11.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204663

Resumo

A maturação oocitária é uma importante etapa da produção in vitro de embriões, sendo dependente da qualidade do oócito, a qual determina sua competência ao desenvolvimento. A estimulação hormonal ovariana com gonadotrofinas pode influenciar a expressão gênica nas células cumulus (CCs) de complexos cumulus-oócito (CCOs) e, consequentemente, a qualidade oocitária. Adicionalmente, a maturação in vitro (MIV) dos CCOs envolve a síntese de ácido hialurônico para que haja a expansão do cumulus. Nesse evento, também ocorre a regulação da expressão de conexinas, as quais compõem as junções gap existentes entre o cumulus e o oócito. Assim, no presente trabalho, em paralelo à classificação morfológica (GI/II ou GIII) e avaliação da taxa de MIV, investigou-se a expressão dos genes que codificam a enzima ácido hialurônico sintase-2 (HAS2), os receptores gonadotróficos do hormônio folículo estimulante (FSHR) e do luteinizante (LHR) e a conexina 43 em CCs oriundas de CCOs caprinos obtidos após estimulação hormonal ovariana com múltiplas doses de FSH (MD) ou única dose de FSH/eCG (Oneshot - OS). Adicionalmente, CCOs bovinos oriundos de abatedouro foram utilizados como grupo controle. O tratamento MD produziu maior número de folículos grandes (>4 mm), CCOs com melhor aspecto morfológico (GI/II) e melhor taxa de MIV que OS. O tratamento OS produziu CCOs com CCs que apresentaram maior nível de transcritos para todos os genes analisados. Esta maior expressão gênica também foi observada em CCs de CCOs com aspecto morfológico inferior (GIII). Por outro lado, os níveis de RNAm tornaram-se mais semelhantes entre os grupos após a MIV, principalmente com o decréscimo dos transcritos para FSHR e LHR. Alguns eventos que ocorreram durante a MIV bovina, como a expansão das células, o aumento de HAS2 e decréscimo de Cx43, foram menos evidentes ou não observados na MIV caprina. Em conclusão, o tratamento OS produziu CCOs com maior nível de transcritos para HAS2, receptores gonadotróficos e conexina 43, comparado a MD. Contudo, esse maior nível de transcritos não conferiu maior competência meiótica aos oócitos e pode estar relacionado a uma regulação deficiente da expressão gênica por oócitos de menor qualidade. Finalmente, a expansão, o aumento da expressão de HAS2 e o decréscimo da síntese de Cx43, parecem ser eventos mais evidentes nas CCs de CCOs durante a MIV bovina que na caprina. Estudos adicionais são ainda necessários para investigar a importância de outras isoformas de HAS ou de conexinas em CCOs caprinos.


The oocyte maturation is an important step of in vitro embryo production, being dependent on oocyte quality, which determines their competence development. Ovarian stimulation with gonadotropins can influence gene expression in the cumulus cells (CCs) of cumulus-oocyte complexes (COCs) and, consequently, the oocyte quality. Additionally, in vitro maturation (IVM) of COCs involves hyaluronic acid synthesis for cumulus expansion. In this event, there is also the regulation of connexin expression, which make up the gap junctions existing between the cumulus and oocyte. In the present work, in parallel with the morphological classification (GI/II or GIII) and evaluation of IVM rate, we investigated the expression of genes encoding the enzyme hyaluronic acid synthase-2 (HAS2), the gonadotropic receptors of follicle stimulating hormone (FSHR) and luteinizing hormone (LHR) and connexin 43 in CCs derived from COCs goats obtained after ovarian hormonal stimulation with multiple doses of FSH (MD) or a single dose of FSH/eCG (OS). The MD treatment produced higher number of large follicles, COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. Additionally, bovine COCs originating from slaughterhouse were used as control group. The MD treatment produced higher number of large follicles (>4 mm), COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. The OS treatment produced COCs with more HAS2, FSHR, LHR and Cx43 transcripts. This gene expression pattern was also observed in CCs of COCs showing poor morphological characteristics. On the other hand, the mRNA levels becomes more similar between groups after IVM, mainly decreasing FSHR and LHR transcripts. Some events that occurred during the bovine IVM, such as the expansion of the cells, the increase of HAS2 and decrease of Cx43 were less apparent or not observed in goat IVM. In conclusion, the OS treatment produced COCs with a higher level of transcripts for HAS2, gonadotropic receptors and connexin 43, compared to MD. However, increasing in HAS2, FSHR, LHR and Cx43 expressions in goat COCs do not confer more meiotic competence to oocytes. Instead, it may be resulted from a poor regulation of gene expression in CCs by lower quality oocytes. Finally, cumulus expansion together with HAS2 upregulation and Cx43 downregulation seems to be more important IVM events for bovine than for goat COCs. Further studies are needed to investigate the importance of other HAS isoforms or connexins in goat COCs.

12.
Braz. j. vet. pathol ; 3(1): 24-30, may 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1469823

Resumo

Angiogenesis is involved in several physiological and pathological processes, and the proliferation of endothelial cells is a central event in the generation of new blood vessels. Gap junctions (GJ) are membrane structures that communicate adjacent cells, contribute to tissue homeostasis, and are important to the control of cell proliferation. Connexins (Cxs) are the proteins that form gap junctions. Endothelial cells may express Cx43, Cx37 and Cx40. In this study, we analyzed the effect of the heterologous deletion of the Gja1 (Cx43 gene) on the development of newly formed blood vessels (NFBV) in the mouse cornea. Heterozygous (Cx43+/-) and wild-type (Cx43+/+) mice were submitted to the silver crystal corneal cauterization model. Two parameters were quantified by image analysis 2 or 6 days after cauterization: NFBV density and length. At days 2 and 6 after corneal cauterization, Cx43+/- mice showed smaller density of NFBV as compared to Cx43+/+ mice. Therefore, deletion of one Gja1 allele (connexin-43 gene) may lead to impaired cell-cell communication in endothelial cells, diminishing angiogenesis after cauterization of the mouse cornea


Assuntos
Animais , /farmacologia , Células Endoteliais/patologia , Neovascularização da Córnea/cirurgia , Neovascularização da Córnea/veterinária , Sinapses Elétricas/patologia , Homeostase , Triagem de Portadores Genéticos
13.
Braz. J. Vet. Pathol. ; 3(1): 24-30, may 2010. ilus
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-2550

Resumo

Angiogenesis is involved in several physiological and pathological processes, and the proliferation of endothelial cells is a central event in the generation of new blood vessels. Gap junctions (GJ) are membrane structures that communicate adjacent cells, contribute to tissue homeostasis, and are important to the control of cell proliferation. Connexins (Cxs) are the proteins that form gap junctions. Endothelial cells may express Cx43, Cx37 and Cx40. In this study, we analyzed the effect of the heterologous deletion of the Gja1 (Cx43 gene) on the development of newly formed blood vessels (NFBV) in the mouse cornea. Heterozygous (Cx43+/-) and wild-type (Cx43+/+) mice were submitted to the silver crystal corneal cauterization model. Two parameters were quantified by image analysis 2 or 6 days after cauterization: NFBV density and length. At days 2 and 6 after corneal cauterization, Cx43+/- mice showed smaller density of NFBV as compared to Cx43+/+ mice. Therefore, deletion of one Gja1 allele (connexin-43 gene) may lead to impaired cell-cell communication in endothelial cells, diminishing angiogenesis after cauterization of the mouse cornea(AU)


Assuntos
Animais , Neovascularização da Córnea/cirurgia , Neovascularização da Córnea/veterinária , Células Endoteliais/patologia , Conexina 43/farmacologia , Sinapses Elétricas/patologia , Homeostase , Triagem de Portadores Genéticos
14.
Pesqui. vet. bras ; 29(4): 353-357, 2009. ilus, tab
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-514

Resumo

The connexin 32 (Cx32) is a protein that forms the channels that promote the gap junction intercellular communication (GJIC) in the liver, allowing the diffusion of small molecules through cytosol from cell-to-cell. Hepatic fibrosis is characterized by a disruption of normal tissue architeture by cellular lesions, and may alter the GJIC. This work aimed to study the expression and distribution of Cx32 in liver fibrosis induced by the oral administration of dimethylnitrosamine in female Wistar rats. The necropsy of the rats was carried out after five weeks of drug administration. They presented a hepatic fibrosis state. Sections from livers with fibrosis and from control livers were submitted to immunohistochemical, Real Time-PCR and Western-Blot analysis to Cx32. In fibrotic livers the Cxs were diffusely scattered in the cytoplasm, contrasting with the control livers, where the Cx32 formed junction plaques at the cell membrane. Also it was found a decrease in the gene expression of Cx32 without reduction in the protein quantity when compared with controls. These results suggest that there the mechanism of intercellular communication between hepatocytes was reduced by the fibrotic process, which may predispose to the occurrence of a neoplastic process, taken in account that connexins are considered tumor suppressing genes.(AU)


A conexina 32 (Cx32) é uma proteína que constitui os canais que promovem as comunicações intercelulares via junções comunicantes (CIJC) no fígado, permitindo difusão de pequenas moléculas citoplasmáticas de uma célula à outra. A fibrose hepática caracteriza-se pela alteração da arquitetura normal do fígado e podem alterar as CIJCs. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão e distribuição de Cx32 na fibrose hepática. O objetivo do presente trabalho foi estudar a expressão e distribuição da Cx32 em fígados com fibrose induzida pela administração oral de dimetilnitrosamina em fêmeas de ratos Wistar. A necropsia foi realizada após cinco semanas da última administração da droga e observou-se um quadro de fibrose hepática. Amostras dos fígados com fibrose e de animais controle foram submetidas à análise imunoistoquímica, por Real Time-PCR e por Western-Blot verificando-se a presença de Cx32 difusa e dispersa no citoplasma dos fígados com fibrose. No grupo controle a Cx32 localizou-se na membrana citoplasmática com a formação de placas juncionais. O fígado com fibrose também revelou diminuição da expressão gênica de Cx32, embora sem a redução da quantidade do produto protéico, quando comparado ao grupo controle. Estes resultados sugerem que o mecanismo de comunicação intercelular entre os hepatócitos reduziu-se durante o processo fibrótico, o que pode predispor a ocorrência de processos neoplásicos, uma vez que as conexinas são consideradas genes supressores de tumores.(AU)


Assuntos
Animais , Fígado/anatomia & histologia , Fígado/patologia , Imuno-Histoquímica/métodos , Dimetilnitrosamina/administração & dosagem , Dimetilnitrosamina/efeitos adversos , Ratos
15.
Braz. j. vet. pathol ; 1(1): 36-45, 2008. ilus, tab
Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: biblio-1435974

Resumo

Gap junctions are sites on the cellular membrane with intercellular channels build up by twelve protein subunits called connexins. Each connected cell contributes with a hemichannel made up by six connexins subunits. This kind of connection represents and efficient way of intercellular communication in most tissues, including the nervous system. It works as a passage for ions, secondary messenger and metabolites exchange between the cells. In a complex tissue like the nervous tissue they are particularly important because they connect the various cellular types composing a panglial syncytium that performs neuronal protection and tissue homeostasis. The expression of connexins and the intercellular communication through gap junctions are crucial to regulate vital functions as cellular motility, proliferations and survival; changes in the conformational expression of connexins may be involved in diseases as Alzheimer's disease, neoplasms, bacterial and parasitic infections, or even affect cellular groups when they occur as genetic mutations leading to functional defects of the nervous system as demyelination in the PNS (Charcot-Marie-Tooth disease), hereditary epilepsy, non-syndromic deafness and senile cataract.


Assuntos
Junções Comunicantes/fisiologia , Conexinas/análise , Doenças do Sistema Nervoso/fisiopatologia , Epilepsia , Esclerose Lateral Amiotrófica
16.
São Paulo; s.n; 19/08/2011.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-5498

Resumo

O papel das junções intercelulares comunicantes do tipo gap e das proteínas que as compõem, as conexinas, tem sido alvo de numerosos estudos no campo da oncologia. Com a finalidade de compreender melhor os mecanismos moleculares envolvidos no processo carcinogênico e desenvolver novas armas contra o câncer, estes estudos têm se mostrado promissores, porém com muitas perguntas ainda a serem respondidas. Com o objetivo de avaliar a interferência da conexina 43 no processo carcinogênico, administramos o carcinógeno DMBA, um hidrocarboneto aromático policíclico, nas doses hebdomadárias de 1 mg durante 9 semanas, à camundongos BALB/c geneticamente modificados heterozigotos para a conexina 43 (Cx43+/-) e wild-type (Cx43+/+). O desenvolvimento de neoplasias ocorreu em 100% dos animais que receberam DMBA, porém de forma variável quanto ao tempo, tipo e número de neoplasias. No total, 6 tipos neoplásicos foram observados, incluindo neoplasias mamária, linfoma, pulmonar, gástrica, cutânea e ovariana, nesta ordem de prevalência. Com relação às neoplasias mamárias, as mamas abdominais foram as mais acometidas e o adenoacantoma foi o tipo histológico mais comum. No pulmão, estômago e pele, o tipo neoplásico mais comum em cada um foi, respectivamente, adenocarcinoma alveolar papilar, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células escamosas queratinizante. Foi observada diferença estatística significante na incidência de tumores ovarianos, entre os grupos Cx43+/- e Cx43+/-, com maior incidência em animais Cx43+/-, indicando interferência da Cx43 neste processo carcinogênico. Apenas os animais Cx43+/- desenvolveram este tipo neoplásico, o qual foi representado exclusivamente por tumores da célula da granulosa. Não houve diferença estatística significante na incidência dos demais tumores, embora, em números absolutos, a incidência de quase todas, à exceção das neoplasias cutâneas, tenha sido maior nos Cx43+/-. O mesmo se repetiu com relação ao desenvolvimento de metástases, cujo fenótipo foi observado apenas em neoplasias mamárias e gástricas. A utilização de doses elevadas (9mg) de DMBA parece interferir na resposta, mais notadamente a pulmonar. As conexinas atuam de forma complexa e variável entre os diferentes tumores e entendimento da relação das conexinas com o câncer depende do entendimento molecular do controle da expressão das conexinas. Com este trabalho esperamos contribuir para evolução dos estudos relativos ao seu papel no processo carcinogênico e, desta forma, auxiliar no desenvolvimento de meios de previnir e combater o câncer


The role of the intercellular communication of gap junctions and of the proteins that form these junctions, the connexins, has been the subject of numerous studies in the field of oncology. In order to better understand the molecular mechanisms involved in the carcinogenic process and develop new weapons against cancer, these studies have shown promising, but with many questions still to be answered. Aiming to evaluate the interference connexin 43 in the carcinogenic process the carcinogen DMBA, one aromatic hydrocarbon polycyclic, was administered to genetically modified BALB;c mice heterozygous for the connexin 43 (Cx43 +/-) and wild-type (Cx43 +/+). The development of cancer occurred in 100% of animals receiving DMBA, but in different timing, types and number of tumors. In total, six types of neoplasm were observed, including breast, lymphoma, lung, gastric, skin and ovarian cancers, in that order of prevalence. Regarding breast cancer, abdominal breasts were the most affected and adenoacanthoma was the most common histological type. In the lung, stomach and skin, the most common tumor type in each was, respectively, papillary alveolar adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and keratinizing squamous cell carcinoma. There was statistically significant difference in the incidence of ovarian tumors among groups Cx43 + / - and Cx43 + / -, indicating interference of the expression of Cx43 +/- in the carcinogenic process. Only animals of the Cx43 + / - developed this tumor type, which was represented exclusively by granulosa cell tumors. There was no statistically significant difference in the incidence of other tumors, although in absolute numbers, the incidence of almost all, except for skin cancers, was higher in Cx43 + / -. The same was repeated with respect to the development of metastases, wereas observed only in breast and gastric cancers. The use of high doses (9 mg) of DMBA appears to interfere with the carcinogenic response, most notably in the lung. Connexins act in complex and variable ways among different tumors and understanding of the relationship of connexins in cancer depends on understanding the molecular control of expression of connexins. With this work we hope to contribute to the development of studies about role of connexins in the carcinogenic process and thus help in developing ways to prevent and fight cancer

17.
São Paulo; s.n; 27/05/2011.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-5488

Resumo

A eletroporação é um fenômeno que promove a formação de poros na membrana citoplasmática quando esta é submetida à exposição de um campo elétrico específico. Dentre as principais aplicações da eletroporação podemos citar a eletroquimioterapia, uma nova terapia contra o câncer, e a terapia gênica, ainda em desenvolvimento. As conexinas são unidades formadoras das junções gap, canais transmembrana responsáveis pela comunicação intercelular e que participam de uma serie de eventos fisiológicos como o crescimento e diferenciação celular. A importância desta família de genes na oncologia está cada vez mais clara dadas às evidencias de seu comportamento de supressor de tumor ou como facilitador da disseminação e metástases de acordo com a fase de em que o câncer se apresenta. A eletroporação como um fenômeno que promove perturbação em membrana poderia interferir de alguma forma na expressão das conexinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos de interferência na expressão gênica das células promovidos pela eletroporação em especial na família de genes das conexinas. Para tanto as células foram expostas a um campo semelhante a o utilizado para eletroquimioterapia e avaliadas em diferentes tempos após a exposição. Três linhagens, duas neoplásicas (melanoma B16/BL6 e E9) e uma linhagem não neoplásica (E10) foram utilizadas como modelo experimental para que pudesse ser feita uma analise comparativa e a avaliação dos possíveis diferentes comportamentos das mesmas frente à eletroporação. O estudo da expressão gênica foi realizado pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. A Cx 26 foi avaliada na linhagem B16/BL6 e a Cx 43 nas linhagens E9 e E10. Os resultados da imunofluorescência apontaram uma marcação no citoplasma em B16/BL6, predominantemente em núcleo para a linhagem E9 e em núcleo e citoplasma em E10. Somente a linhagem E9 apresentou diferentes marcações entre os grupos, com uma marcação em citoplasma no grupo t1/2 (30 minutos apos a eletroporacao) O western blot mostrou diminuição transiente para as Cxs apenas nas linhagens neoplásicas nos grupos t1/2 e t1 (1 hora apos a eletroporacao). A linhagem E10 apresentou aumento de expressão nos mesmos grupos. O PCR em tempo real apresentou diferenças significativas nos tempos t1/2 e t1 para as linhagens B16/BL6 e E10. A linhagem B16/BL6 teve diminuição de RNAm enquanto a linhagem E10 apresentou aumento de transcrição de RNAm. A linhagem E9 apresentou padrão de expressão bastante heterogêneo. Frente aos resultados apresentados podemos concluir que a eletroporação interferiu de maneira transiente na expressão de conexinas


Electroporation is a phenomenon that promotes the formation of pores in the cytoplasmic membrane when it is exposed to a specific electric field. The main applications of electroporation include the electrochemotherapy, a new cancer therapy, and gene therapy, still in development. Connexins are forming units of gap junctions, transmembrane channels responsible for intercellular communication and participating in a series of physiological events such as cell growth and differentiation. The importance of this gene family in oncology is increasing. The evidence of its behavior as a tumor suppressor or facilitator of dissemination and metastases according to the stage where the cancer presents itself. Electroporation as a phenomenon that promotes membrane disruption could interfere somehow in the expression of connexins. The aim of this study was to evaluate the possible effects of interference in gene expression. of cells promoted by electroporation in particular gene family of connexins. For this purpose cells were exposed to a electric field similar to that used for Electrochemotherapy and evaluated at different times after exposure. Three cell lines, two neoplastic (melanoma B16/BL6 and E9) and one line non-neoplastic (E10) were used as experimental models that could provide a comparative analysis between the lines and an assessment of the possible different behaviors due to electroporation. Its expression was assessed by immunofluorescence, western blot and real-time PCR. Cx 26 was evaluated in the melanoma cell line B16/BL6 and Cx 43 in the cell lines E9 and E10. The results showed a cytoplasm immunofluorescence staining pattern in the in B16/BL6, predominantly in the nucleus in line E9 and in the nucleus and cytoplasm for cell line E10. Only the cell line E9 had different immunoflurescence stainings between the groups, with a positivity in the cytoplasm in the group t1/2. The western blot showed transient decrease of Cxs only in cell lines neoplastic in the times t1/2 and t1. The lung cell line E10 showed increased expression in the same time points. The real-time PCR showed significant differences in t1/2 and t1 for the cell lines B16/BL6 and E10. The melanoma cell line B16/BL6 had mRNA decreased while the cell line E10 showed increased transcription of mRNA. The cell line E9 showed a very heterogeneous expression pattern. According to our results, we can conclude that electroporation interfered transiently in the expression of connexins

18.
São Paulo; s.n; 23/02/2011.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-5490

Resumo

Melanoma é uma neoplasia maligna com comportamento agressivo considerado o câncer mais comum da cavidade bucal de cães. Ele pode ser classificado quanto a morfologia celular em epitelióide, fusiforme e misto ou quanto ao fenótipo: melânico ou amelânico. Estudos têm sugerido que os melanomas amelânicos são mais agressivos. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento dos melanomas da cavidade bucal dos cães, quantificando a expressão das Cx26 e 43, caderina-E, MMPs 2 e 9 e proliferação celular. Para tanto foram coletados 25 melanomas provenientes de cães atendidos no HOVET FMVZ-USP (16 melânicos e 9 amelânicos). Após a cirurgia os animais foram acompanhados até a morte, sendo que 5 animais foram eutanasiados (2 antes da cirurgia e 3 após o procedimento cirúrgico, devido ao sofrimento físico). Os tumores eram diagnosticados através do histopatológico e classificados de acordo com OMS (1998). Para confirmação dos melanomas amelânicos foi utilizado à técnica de imuno-histoquímica com o perfil de anticorpos pré-estabelecidos. A proliferação celular foi quantificada através do uso de PCNA, índice apoptótico e caspase-3. O comportamento tumoral foi avaliado através da técnica de imuno-histoquímica para caderina-E e MMPs 2 e 9. E a expressão das Cxs foram avaliadas através da imunofluorescência e western blot. Cães com melanma amelânico apresentaram menor sobrevida, com aumento do número de metástase, fraca marcação para caderina-E e alta intensidade para as MMPs 2 e 9, aumento de células positivas para PCNA e índice mitótico, e diminuição da caspase-3, não havendo diferença significante quanto aos tipos histotógicos. Houve diminuição de expressão das Cxs entre os amelânicos, no entanto, aumento da síntese do gene de CX 26 entre o mesmo grupo, o que se verificou através do PCR em Tempo Real. Nossos achados sugerem que os melanomas da cavidade bucal de cães apresentam um comportamento mais agressivo


Melanoma is a malignant neoplasm with aggressive behavior considered the most common cancer of the buccal cavity in dogs. It can be classified as cell morphology in epithelioid, spindle and mixed or on the phenotype, in melanotic or amelanotic. Studies have suggested that amelanotic melanomas are more aggressive. The aim of this study was to evaluate the behavior of melanoma of the buccal cavity of dogs, quantifying the expression of Connexins 26 and 43, E-cadherin, MMPs 2 and 9 and cell proliferation. For both melanomas were collected from 25 dogs attended at HOVET FMVZ (USP) (16 melanotic and 9 amelanotic melanomas). After the surgery, the animals were followed until death, so 5 animals were euthanized (2 before surgery and 3 after surgery, due to physical suffering). The tumors were diagnosed by histopathology and classified according to WHO (1998). For confirmation of amelanotic melanomas it was used the technique of immune-histochemistry with the antibody profile pre-established. Cell proliferation was quantified by using PCNA, apoptotic index and caspase-3. The tumor behavior was evaluated using the technique of immune-histochemistry for E-cadherin and MMPs 2 and 9. And the expression of Cxs was evaluated by immune-fluorescence and western blot. Dogs with amelanotic melanoma had lower survival with increasing number of metastatic, weak immunoreactivity for E-cadherin and high intensity for MMP 2 and 9, an increase of cells positive for PCNA and mitotic index, and decreased caspase-3, no significant difference in the morphologic subtypes. There was a decrease of expression of Cxs between amelanotic, however, increased synthesis of CX 26 gene among the same group, which was verified by real time PCR. Our findings suggest that melanomas of the buccal cavity of dogs exhibited more aggressive behavior

19.
São Paulo; s.n; 23/04/2010.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-5471

Resumo

A fibrose hepática resulta da cronicidade da injúria celular, ocasionando acúmulo dos componentes da matriz extracelular (MEC) pela ativação, principalmente, de células estreladas e fibroblastos portais em miofibroblastos. Estas células se conectam através de junções comunicantes do tipo gap, formadas por proteínas denominadas conexinas (Cx). As junções gap são responsáveis pelo fluxo de moléculas e íons entre as células, desempenhando importante função no controle da homeostasia tecidual. Diversos tipos de conexinas foram descritas nas células hepáticas. Os hepatócitos expressam Cx32 e Cx26, enquanto as demais células não-parenquimatosas expressam Cx43. Alguns estudos analisaram a expressão das conexinas e das junções gap em processos de reparação e fibrogênese em diferentes tecidos, no entanto, poucos avaliaram seu papel na fibrogênese hepática. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos morfológicos, histopatológicos e moleculares da fibrose hepática, induzida por tetracloreto de carbono (CCl4), em animais deficientes para as conexinas 43 (Cx43+/-) ou 32 (Cx32-/-). Foram analisados dados biométricos, histopatológicos, ultra-estruturais, imuno-histoquímicos e bioquímicos, além da expressão gênica e protéica das conexinas. Os aspectos moleculares da fibrose hepática foram analisados pela expressão de genes relacionados com a deposição e degradação da matriz extracelular por PCR em tempo real. As análises macroscópicas e de varredura demonstraram um processo de micronodulação da superfície hepática mais acentuado nos camundongos Cx43+/- fibróticos em relação aos animais wild-type (Cx43+/+) fibróticos. Adicionalmente, estes animais apresentaram maior proporção volumétrica de colágeno no tecido hepático; redução na atividade necroinflamatória tecidual; redução nas concentrações séricas de AST e ALT; redução na proliferação celular dos hepatócitos e redução na expressão dos genes: colágeno tipo I, TGFβ-1, MMP-2, MMP-13 e TIMP-1. Por sua vez, os camundongos Cx32-/- fibróticos apresentaram aumento na deposição de colágeno no parênquima hepático; aumento na atividade necroinflamatória tecidual e aumento nos níveis séricos das enzimas hepáticas AST, ALT e fosfatase alcalina em comparação aos animais wild-type (Cx32+/+) fibróticos. Também foram observadas redução na proliferação hepatocelular e maior quantidade de corpúsculos apoptóticos no tecido hepático. Baseando-se em todos os resultados obtidos, observou-se que ambos os modelos animais apresentaram aumento da fibrose hepática, aparentemente ocasionada por diferentes modos de ação. Os animais deficientes em Cx43 apresentaram menor capacidade de degradação do colágeno, ocasionando seu acúmulo no tecido hepático. Por outro lado, os animais deficientes em Cx32 apresentaram maior deposição de colágeno em resposta à injúria hepatocelular mais acentuada, aliada ao desequilíbrio entre as taxas de proliferação celular e apoptose. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram a importante participação das conexinas no controle da fibrogênese hepática, e que podem representar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento das doenças hepáticas crônicas em humanos e animais


Hepatic fibrosis results from chronic cell injury, leading to accumulation of components of extracellular matrix (ECM) through activation mainly of hepatic stellate cells and portal fibroblasts into myofibroblasts. These cells communicate through intercellular gap junctions composed of proteins known as connexins (Cx). Gap junctions are responsible for the exchange of molecules and ions among cells, playing an important role in the control of tissue homeostasis. Several subtypes of connexins were described among hepatic cells. Hepatocytes express Cx32 and Cx26, while the other non-parenchymal cells express Cx43. Some studies analyzed the expression of connexins and gap junctions on processes of healing and fibrogenesis in different tissues; however, few studies evaluated its role on hepatic fibrogenesis. Thus, the objective of this study was to evaluate morphological, histopathological and molecular aspects of hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) in animals with connexin 43 (Cx43+/-) or 32 (Cx32-/-) deficiency. We analyzed biometric, histopathological, ultrastructural, immunohistochemical and biochemical data, besides gene and protein expression of connexins. Molecular aspects of hepatic fibrosis were analyzed with the expression of genes related to deposition and degradation of extracellular matrix by real time PCR. Macroscopic and Scanning Electron Microscopy analyses showed a process of micronodulation of hepatic surface more accentuated on Cx43+/- fibrotic mice when compared to fibrotic wild-type (Cx43+/+) animals. Additionally, these animals presented a higher collagen volumetric proportion on hepatic tissue; reduction of tissue necroinflammatory activity; reduction of serum AST and ALT; reduction of hepatocytes proliferation and reduction of expression type I collagen, TGFβ-1, MMP-2, MMP-13 and TIMP-1 genes. Fibrotic Cx32-/- mice presented an increase of collagen deposition in hepatic parenchyma; increase of tissue necro-inflammatory activity and increase of liver enzymes AST, ALT and alkaline phosphatase when compared to fibrotic wild-type (Cx32+/+) animals. Reduction of hepatocellular proliferation and a higher amount of apoptotic bodies on hepatic tissue were also observed. Based on the results obtained, we observed that both animal models showed an increase of hepatic fibrosis, apparently caused by different modes of action. Cx43 deficient animals showed a reduced capacity to degrade collagen, causing its accumulation in the hepatic tissue. Cx32 deficient animals showed an increased collagen deposition in response to accentuated hepatocellular injury, together to an unbalance between rates of cellular proliferation and apoptosis. In conclusion, results obtained on this study demonstrate an important role of connexins on the control of hepatic fibrogenesis, which could represent potential therapeutical targets for the treatment of chronic liver diseases in humans and animals

20.
São Paulo; s.n; 10/05/2010.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-5461

Resumo

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central


Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS

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