A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

O papel da gota citoplasmática na funcionalidade de espermatozoides em mamíferos: uma revisão atualizada / The role of cytoplasmic droplet over sperm functionality in mammals: an updated review

A gota citoplasmática é uma protuberância de citoplasma geralmente posicionada na peça intermediária dos espermatozoides. É considerada uma organela transitória, uma vez que migra pelo espermatozoide durante o trânsito epididimário, quando é removida dessas células na maioria dos mamíferos. Dúvidas sobre se a presença desta gota está relacionada de forma positiva ou negativa com a função e fertilidade espermática são frequentes, já que sua presença no ejaculado pode afetar a fertilidade espermática e o uso do sêmen em biotécnicas da reprodução. Porém, mesmo não sendo totalmente compreendida a nível molecular e funcional, sabe-se que a gota citoplasmática é necessária ao espermatozoide durante seu processo de maturação no epidídimo. Por isso, o objetivo desta revisão foi abordar pontos sobre a fisiologia e funções das gotas citoplasmáticas, bem como relacionar sua presença com a maturação e fertilidade dos espermatozoides.(AU)

The cytoplasmic droplet is a protuberance of cytoplasm usually positioned in the sperm midpiece. It is considered a transient organelle that migrates through the sperm cell during its epididymal transit when it is finally removed from the cell in most mammals. Doubts over whether the presence of cytoplasmic droplets is positively or negatively related to sperm functions and fertility are common, as its presence in the ejaculate may affect sperm fertility and the use of semen in assisted reproductive technology. Although the understanding of cytoplasmic droplets function is not fully clarified at molecular and functional levels, it is known that cytoplasmic droplet is necessary for spermatozoa, especially during their maturation in the epididymal duct. Therefore, the aim of this review was to discuss aspects of the physiology and function of cytoplasmic droplets, as well as to relate their presence to sperm maturation and their consequent fertility.(AU)

O papel da gota citoplasmática na funcionalidade de espermatozoides em mamíferos: uma revisão atualizada / The role of cytoplasmic droplet over sperm functionality in mammals: an updated review

A gota citoplasmática é uma protuberância de citoplasma geralmente posicionada na peça intermediária dos espermatozoides. É considerada uma organela transitória, uma vez que migra pelo espermatozoide durante o trânsito epididimário, quando é removida dessas células na maioria dos mamíferos. Dúvidas sobre se a presença desta gota está relacionada de forma positiva ou negativa com a função e fertilidade espermática são frequentes, já que sua presença no ejaculado pode afetar a fertilidade espermática e o uso do sêmen em biotécnicas da reprodução. Porém, mesmo não sendo totalmente compreendida a nível molecular e funcional, sabe-se que a gota citoplasmática é necessária ao espermatozoide durante seu processo de maturação no epidídimo. Por isso, o objetivo desta revisão foi abordar pontos sobre a fisiologia e funções das gotas citoplasmáticas, bem como relacionar sua presença com a maturação e fertilidade dos espermatozoides.

The cytoplasmic droplet is a protuberance of cytoplasm usually positioned in the sperm midpiece. It is considered a transient organelle that migrates through the sperm cell during its epididymal transit when it is finally removed from the cell in most mammals. Doubts over whether the presence of cytoplasmic droplets is positively or negatively related to sperm functions and fertility are common, as its presence in the ejaculate may affect sperm fertility and the use of semen in assisted reproductive technology. Although the understanding of cytoplasmic droplets function is not fully clarified at molecular and functional levels, it is known that cytoplasmic droplet is necessary for spermatozoa, especially during their maturation in the epididymal duct. Therefore, the aim of this review was to discuss aspects of the physiology and function of cytoplasmic droplets, as well as to relate their presence to sperm maturation and their consequent fertility.

Use of natural antioxidants in in vitro mammalian embryo production / Uso de antioxidantes naturais na produção in vitro de embriões de mamíferos

In vitro embryo production (IVEP) contributes to the quantitative and qualitative aspects of animal reproduction. Nevertheless, inherent technical factors such as oxidative stress can negatively influence the result and this can impair cell metabolism, thus decreasing the rates of in vitro development, and necessitating the supplementation of culture medium with antioxidants. In this context, compounds of natural origin with this property have been highlighted because of the positive results obtained at different stages of IVEP. Thus, this review aims to present the results obtained by using natural antioxidants to minimize the effects of oxidative stress on gametes and embryos. A variety of natural isolated substances and mixtures (essential oils and extracts) have been studied for supplementation of IVEP media, at stages of in vitro maturation, sperm capacitation, in vitro fertilization, and in vitro development of embryos in different mammalian species. Generally, beneficial effects are observed according to the concentration used, thus demonstrating the potential of several natural antioxidants. Therefore, the main challenges in using these compounds as antioxidants during IVEP include proving their efficiency against free radicals and determining the best concentration at each stage. In addition, understanding the mechanisms of action of such antioxidants is crucial...

A produção in vitro de embriões (PIVE) contribui para os aspectos quantitativos e qualitativos da reprodução animal. Contudo, fatores inerentes da técnica, como o estresse oxidativo, podem influenciar negativamente o resultado e isso pode prejudicar o metabolismo celular, diminuindo assim as taxas de desenvolvimento in vitro, e exigindo a suplementação do meio de cultivo com antioxidantes. Neste contexto, os compostos de origem natural com essa propriedade têm se destacado devido aos resultados positivos obtidos em diferentes estágios da PIVE. Assim, esta revisão pretende apresentar os resultados obtidos usando antioxidantes naturais para minimizar os efeitos do estresse oxidativo em gametas e embriões. Uma variedade de substâncias isoladas e de misturas naturais (óleos essenciais e extratos) tem sido estudada para a suplementação de meios de PIVE, nas etapas de maturação in vitro, capacitação espermática, fecundação in vitro e desenvolvimento in vitro de embriões em diferentes espécies de mamíferos. Geralmente, os efeitos benéficos são observados de acordo com a concentração utilizada, demostrando assim o potencial positivo de vários antioxidantes naturais. Portanto, os principais desafios para o uso desses compostos como antioxidantes durante a PIVE incluem provar sua eficiência contra os radicais livres e determinar a melhor concentração em cada etapa. Além disso...

Use of natural antioxidants in in vitro mammalian embryo production / Uso de antioxidantes naturais na produção in vitro de embriões de mamíferos

In vitro embryo production (IVEP) contributes to the quantitative and qualitative aspects of animal reproduction. Nevertheless, inherent technical factors such as oxidative stress can negatively influence the result and this can impair cell metabolism, thus decreasing the rates of in vitro development, and necessitating the supplementation of culture medium with antioxidants. In this context, compounds of natural origin with this property have been highlighted because of the positive results obtained at different stages of IVEP. Thus, this review aims to present the results obtained by using natural antioxidants to minimize the effects of oxidative stress on gametes and embryos. A variety of natural isolated substances and mixtures (essential oils and extracts) have been studied for supplementation of IVEP media, at stages of in vitro maturation, sperm capacitation, in vitro fertilization, and in vitro development of embryos in different mammalian species. Generally, beneficial effects are observed according to the concentration used, thus demonstrating the potential of several natural antioxidants. Therefore, the main challenges in using these compounds as antioxidants during IVEP include proving their efficiency against free radicals and determining the best concentration at each stage. In addition, understanding the mechanisms of action of such antioxidants is crucial...(AU)

A produção in vitro de embriões (PIVE) contribui para os aspectos quantitativos e qualitativos da reprodução animal. Contudo, fatores inerentes da técnica, como o estresse oxidativo, podem influenciar negativamente o resultado e isso pode prejudicar o metabolismo celular, diminuindo assim as taxas de desenvolvimento in vitro, e exigindo a suplementação do meio de cultivo com antioxidantes. Neste contexto, os compostos de origem natural com essa propriedade têm se destacado devido aos resultados positivos obtidos em diferentes estágios da PIVE. Assim, esta revisão pretende apresentar os resultados obtidos usando antioxidantes naturais para minimizar os efeitos do estresse oxidativo em gametas e embriões. Uma variedade de substâncias isoladas e de misturas naturais (óleos essenciais e extratos) tem sido estudada para a suplementação de meios de PIVE, nas etapas de maturação in vitro, capacitação espermática, fecundação in vitro e desenvolvimento in vitro de embriões em diferentes espécies de mamíferos. Geralmente, os efeitos benéficos são observados de acordo com a concentração utilizada, demostrando assim o potencial positivo de vários antioxidantes naturais. Portanto, os principais desafios para o uso desses compostos como antioxidantes durante a PIVE incluem provar sua eficiência contra os radicais livres e determinar a melhor concentração em cada etapa. Além disso...(AU)

Experimental exposure to 3-monochloropropane-1,2-diol from the pre-puberty causes damage in sperm production and motility in adulthood / Exposição experimental ao 3-monocloropropano-1,2-diol, a partir da pré-puberdade, causaalteração na produção e motilidade espermática na idade adulta

3-Monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) is a food contaminant that can be formed during the thermic processing of various foodstuffs. Studies of reproductive toxicology of 3-MCPD are mainly concentrated in the evaluation of possible insults caused by exposure of adult animals. However, the prepuberty might be a period of different susceptibility to chemicals. The aim of this study was to evaluate the effects on reproductive endpoints of the 3-MCPD-exposure prepubertal male rats. Wistar male rats were assigned to 4 groups: control and exposed to 2.5; 5 or 10 mg kg-1 day-1 of 3-MCPD for 30 days by gavage. Testis and epididymis were used for sperm counts and histology analysis. Sertoli cell number and dynamic of the spermatogenesis were evaluated. Sperm were collected from the vas deferens for evaluation of the sperm motility and morphology. Number of sperm with progressive movement, number of Sertoli cells and germ cells and relative daily sperm production were decreased in the groups exposed to 5 and 10 mg kg-1 day-1 of 3-MCPD. Sperm morphology, testicular and epididymal histology were comparable among groups. Results show that 3-MCPD-exposure of rats from prepuberty might cause alterations in spermatogenesis and sperm maturation, similarly to exposure in adulthood.(AU)

3-monocloropropano-1,2-diol (3-MCPD) é um contaminante alimentar formado durante o processamento térmico de vários produtos. Estudos de toxicologia reprodutiva do 3-MCPD estão concentrados principalmente na avaliação de danos causados pela exposição de animais adultos. No entanto, a peri-puberdade pode ser um período de susceptibilidade diferente a produtos químicos. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos reprodutivos da exposição de ratos machos pré-púberes ao 3- MCPD. Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: controle e expostos a 2,5; 5 ou 10 mg kg-1 dia-1 de 3-MCPD durante 30 dias, por gavagem. Os testículos e epidídimos foram usados para contagem espermática e análise histológica. Foram avaliados o número de células de Sertoli e a dinâmica da espermatogênese. Espermatozoides foram coletados a partir dos ductos deferentes para avaliação da motilidade e morfologia. O número de espermatozoides com movimento progressivo, o número de células de Sertoli e de células germinativas e a produção espermática foram reduzidos nos grupos expostos a 5 e 10 mg kg-1 dia-1 de 3-MCPD. A morfologia espermática e histologia testicular e epididimária foram semelhantes entre os grupos. Os resultados mostram que a exposição de ratos ao 3-MCPD, a partir da prépuberdade, pode causar alterações na espermatogênese e na maturação espermática, de forma semelhante à exposição na idade adulta.(AU)

MicroRNAs: uma nova abordagem para a predição da fertilidade em touros / MicroRNAs: a new approach to predict fertility in bulls

Atualmente, a predição da fertilidade masculina é realizada avaliando diversos aspectosmorfofuncionais (MFF) espermáticos. Em geral, estas características MFF possuem alta correlação com afertilidade. No entanto, existem ejaculados que embora possuam características MFF consideradas adequadasapresentam fertilidade insatisfatória. Assim, há demanda pela busca de novos marcadores que consigam predizera fertilidade dessas amostras seminais. Dentre estes, estão os microRNAs (miRNAs), reguladores póstranscricionais,que desempenham funções importantes na espermatogênese, na maturação espermática e nodesenvolvimento embrionário. Estudos com humanos e bovinos têm mostrado que essas moléculas possuemrelação com a fertilidade. Além disso, já foi descrito também que os miRNAs são altamente regulados nosistema reprodutivo masculino, e principalmente, ao longo da cabeça, corpo e cauda do epidídimo. Atualmenteexistem mais de 790 sequências maduras de miRNAs conhecidas em bovinos e o estabelecimento destes comomarcadores se torna cada vez mais real. Entretanto, o grande desafio destes estudos está em mostrar como estesmiRNAs efetivamente regulam a fertilidade e qual o papel deles nas funções espermáticas e no desenvolvimentoembrionário. Dessa forma, o objetivo desta revisão é compilar os dados existentes na literatura sobre os miRNAse a fertilidade masculina.(AU)

Fertility prediction is performed evaluating several sperm morphological and functional aspects(MFF). In general, MFF features present high correlation with fertility. However, there are ejaculates that,although present normal MFF features, have poor fertility results. So, there is necessity to investigate potentialfertility molecular markers which are able to predict fertility rates. Among them are the microRNAs (miRNAs),which are post-transcriptional regulators molecules that are important to spermatogenesis, sperm maturationand also embryo development. Besides, miRNAs are related with men and bull fertility and are highly regulatedon masculine tract. Currently, there are around 790 mature miRNA sequences in bovine, which could be used asbiomarkers. Nevertheless, the big challenge is to show how miRNAs regulate fertility and their functions onsperm and embryo development. Thus, the goal of this review is to compile the data of scientific literature aboutmiRNAs and male fertility.(AU)

MicroRNAs: uma nova abordagem para a predição da fertilidade em touros / MicroRNAs: a new approach to predict fertility in bulls

Atualmente, a predição da fertilidade masculina é realizada avaliando diversos aspectosmorfofuncionais (MFF) espermáticos. Em geral, estas características MFF possuem alta correlação com afertilidade. No entanto, existem ejaculados que embora possuam características MFF consideradas adequadasapresentam fertilidade insatisfatória. Assim, há demanda pela busca de novos marcadores que consigam predizera fertilidade dessas amostras seminais. Dentre estes, estão os microRNAs (miRNAs), reguladores póstranscricionais,que desempenham funções importantes na espermatogênese, na maturação espermática e nodesenvolvimento embrionário. Estudos com humanos e bovinos têm mostrado que essas moléculas possuemrelação com a fertilidade. Além disso, já foi descrito também que os miRNAs são altamente regulados nosistema reprodutivo masculino, e principalmente, ao longo da cabeça, corpo e cauda do epidídimo. Atualmenteexistem mais de 790 sequências maduras de miRNAs conhecidas em bovinos e o estabelecimento destes comomarcadores se torna cada vez mais real. Entretanto, o grande desafio destes estudos está em mostrar como estesmiRNAs efetivamente regulam a fertilidade e qual o papel deles nas funções espermáticas e no desenvolvimentoembrionário. Dessa forma, o objetivo desta revisão é compilar os dados existentes na literatura sobre os miRNAse a fertilidade masculina.

Fertility prediction is performed evaluating several sperm morphological and functional aspects(MFF). In general, MFF features present high correlation with fertility. However, there are ejaculates that,although present normal MFF features, have poor fertility results. So, there is necessity to investigate potentialfertility molecular markers which are able to predict fertility rates. Among them are the microRNAs (miRNAs),which are post-transcriptional regulators molecules that are important to spermatogenesis, sperm maturationand also embryo development. Besides, miRNAs are related with men and bull fertility and are highly regulatedon masculine tract. Currently, there are around 790 mature miRNA sequences in bovine, which could be used asbiomarkers. Nevertheless, the big challenge is to show how miRNAs regulate fertility and their functions onsperm and embryo development. Thus, the goal of this review is to compile the data of scientific literature aboutmiRNAs and male fertility.

Estudo da espermatogênese e maturação espermática em cães senis

Estudos mais aprofundados dos processos de espermatogênese e maturação epididimária durante a senescência na espécie canina são necessários, permitindo elucidar as características patológicas do ejaculado de cães em idade senil. O presente estudo tem como objetivo comparar entre cães jovens e senis as características vasculares, hemodinâmicas, biométricas e ecogênicas do parênquima testicular e epididimário; a expressão dos receptores de LH, estrógeno e andrógeno no testículo e nos três segmentos epididimários; a morfo-funcionalidade dos espermatozoides provenientes dos três segmentos epididimários e as diferenças histo-morfológicas do parênquima testicular e epididimário. Foram selecionados dez cães jovens em maturidade reprodutiva (1 a 4 anos) e oito cães senis (acima de 7 anos), de diferentes raças, pesando entre 10 e 40 kg, constituindo dois grupos experimentais: Grupo Jovem e Grupo Senil. Os animais foram avaliados por ultrassonografia escrotal bidimensional, Doppler espectral da artéria testicular e Doppler colorido dos testículos e epidídimos. Após orquiectomia, a expressão dos receptores de andrógeno, LH e estrógeno foi avaliada no parênquima testicular e epididimário por meio das técnicas de RT-PCR e imunohistoquímica. Ainda, espermatozoides foram colhidos dos três segmentos epididimários (cabeça, corpo e cauda) e avaliados quanto a motilidade, concentração, morfologia, integridade de membranas acrossomal e plasmática, função mitocondrial e condensação da cromatina espermática. Para análise estatística, foi realizado teste T de Student ou Wilcoxon para comparação entre os grupos e os dados de RT-PCR foram analisados pelo procedimento MIXED, considerando-se P<0,05 para diferenças significativas. O grupo Jovem apresentou maior velocidade de fluxo sanguíneo e menor índice de pulsatilidade na artéria testicular, bem como maior vascularização do parênquima testicular em relação ao Grupo Senil. Os animais senis apresentaram padrão de expressão testicular e epididimário dos receptores de andrógeno, LH e estrógeno alfa distinto dos cães jovens. Não foi constatada a expressão do receptor de estrógeno beta nos testículos e epidídimos de cães. Cães senis apresentaram alterações de concentração espermática, porcentagem de defeitos espermáticos, padrão de motilidade, lesão de membranas plasmática e acrossomal, potencial e atividade mitocondrial e condensação de cromatina dos espermatozoides. Como conclusão, a senescência na espécie canina altera a hemodinâmica da artéria testicular e vascularização dos testículos, sem modificar a biometria e ecogenicidade testicular e epididimária. Ademais, há modificação na expressão diferencial dos receptores hormonais (andrógeno, estrógeno alfa e LH), influenciando o ambiente testicular e epididimário e, por consequência, prejudicando a espermatogênese e maturação espermática no trajeto epididimário, culminando em alterações morfo-funcionais dos espermatozoides em cães.

The study on the spermatogenesis and epididymal maturation in the canine species during senescence is necessary to further elucidate the pathological sperm features of aged dogs. The present study aims to compare between young and senile dogs the vascular, hemodynamic, biometric and echogenic features of testicular and epididymal parenchyma; the tissue expression of LH, estrogen and androgen receptors in the testis and epididymal caput, corpus and cauda; the morpho-functionality of epididymal sperm and the histo-morphological differences of testis and epididymides parenchyma. Ten young dogs within reproductive age (1 to 4 years) and eight senile dogs (over 7 years), of different breeds, weighing between 10 and 40 kg, were selected and assigned to two experimental groups: Young Group and Senile Group. Dogs were evaluated through B-mode scrotal ultrasound, testicular artery spectral Doppler and color Doppler of the testis and epididymides. After orchiectomy, the expression of androgen, LH and estrogen receptors were evaluated in testis and epididymis parenchyma through RT-PCR and immunohistochemistry. Moreover, sperm were harvested from the caput, corpus and cauda epididymides and evaluated for motility, concentration, morphology, integrity of acrosomal and plasma membranes, mitochondrial functioning and chromatin condensation. For statistical analysis, Student's T test or Wilcoxon was performed to compare between the groups and the RT-PCR data were analyzed using proc MIXED, considering P<0.05 as significant different. The Young group showed higher testicular artery blood flow speed and lower pulsatility index, as well as higher testicular vascularization compared to the Senile Group. Senile dogs had different testicular and epididymal expression pattern of androgen, LH and alpha estrogen receptors compared to young dogs. We were not able to detect the expression of beta estrogen receptor in canine testis and epididymis. Senile dogs had significant changes in epididymal sperm concentration, percentage of sperm defects, motility pattern, damage to plasma and acrosomal membranes, mitochondrial potential and activity and sperm chromatin condensation. In conclusion, senescence alters testicular artery blood flow and vascularization of the testis, without modifying testicular and epididymal biometry and echodensity. In addition, hormonal receptors (androgen, alpha estrogen and LH) were differentially expressed in aged dogs, influencing testicular and epididymal environment and, consequently, compromising spermatogenesis and sperm maturation throughout epididymides, leading to morpho-functional changes in canine sperm.

Avaliação da sinalização de zinco em amostras seminais de touros PRÉ e PÓS Percoll® e correlação com o desenvolvimento embrionário

A produção in vitro de embrião (PIVE) em bovinos consiste na maturação do oócito (MIV), fecundação (FIV) e subsequente cultivo in vitro (CIV). Para o sucesso em cada etapa, os gametas precisam de alguns requisitos. Em relação ao espermatozoide, as células precisam ser capacitadas para a fecundação in vitro para gerar o zigoto. O processo de capacitação espermática deixa a célula pronta para a fecundação por meio de alterações funcionais e estruturais resultando em mudanças de permeabilidade na membrana celular, promovendo o influxo de cálcio. Além do cálcio, estudos recentes descreveram a participação do zinco no processo, podendo ser um novo método para avaliar a capacitação espermática. O espermatozoide precisa ser capacitado para fecundar, no entanto, uma capacitação prematura é prejudicial, pois inviabiliza a célula para sua principal função. A manipulação, congelação/descongelação, preparação de espermatozoides para a PIVE e a seleção de células podem ocasionar esta capacitação prematura. Para a FIV, há a necessidade de se separar os espermatozoides com motilidade, sendo o gradiente de densidade Percoll® o mais utilizado em bovinos. Ainda não está claro se a submissão do sêmen a esse gradiente promove a capacitação completa dos espermatozoides, refletindo negativamente na produção in vitro de embriões, sendo este o objetivo do presente estudo. Para tanto, sêmen de 10 touros Nelore, foi submetido (PÓS) ou não (PRÉ) ao gradiente de densidade Percoll®. A motilidade espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA) e a integridade da membrana plasmática (PI) e o potencial de membrana mitocondrial (JC1) por citometria de fluxo. A capacitação espermática foi avaliada por ensaio de fluorescência de clortetraciclina (CTC) e as assinaturas de zinco utilizando a sonda de fluorescência FluoZinTM -3 AM (FZ3). Por fim foi realizado a produção in vitro de embriões utilizando as amostras seminais submetidas ao gradiente Percoll®. Foi realizado a correlação entre as taxas de clivagem, de blastocisto e de desenvolvimento embrionário com as variáveis de capacitação. O grupo PRÉ (não submetido ao gradiente Percoll®) apresentou maior porcentagem de espermatozoides capacitados, quando comparado ao grupo PÓS, que apresentou maior quantidade de espermatozoides não capacitados. O grupo PRÉ apresentou também, maior porcentagem de espermatozoides reagidos na avaliação da CTC e maior porcentagem de espermatozoides com retilinearidade, quando comparados aos espermatozoides submetidos ao gradiente Percoll®. Foi possível observar uma correlação negativa entre a assinatura de zinco (3 e 4) no espermatozoide, que indica células capacitadas, e a taxa de desenvolvimento embrionário in vitro, demostrando que quanto mais células capacitadas PÓS Percoll®, menos embriões são produzidos. O gradiente de densidade Percoll® remove os espermatozoides já capacitados das amostras, confirmado pela maior presença de células não capacitadas após o gradiente. A capacitação de espermatozoides detectada pela assinatura de ZN3 correlaciona negativamente com a taxa de blastocisto e desenvolvimento embrionário.

Evaluation of zinc signaling in seminal samples from bulls PRE and POST Percoll® and correlation with embryonic development Resumo da tese em inglês: The in-vitro production (IVP) of bovine embryos consists in oocyte maturation, fertilization and consequent in-vitro culture. For the success in each step, gametes need some requisites. Concerning the sperm, cells need to be capacitated for in-vitro fertilization to generate the zygote. Sperm capacitation process makes the cell ready for fertilization by functional and structural alterations resulting in permeability changes on cell membrane, which promotes calcium influx. Nevertheless, recent studies described zinc as a new method to assess sperm capacitation. Sperm needs to be capacitated to fertilize, but a premature capacitation is harmful for the process. The manipulation, freezing/thawing, sperm preparation for IVP and cell sorting may be involved with this premature capacitation. For IVP viable cells must be separated form the extender and dead cells, being Percoll® gradient the most used in bovine. It is not yet clear if the submission of semen to a Percoll® gradient promotes complete sperm capacitation, reflecting on in vitro embryo production, being this the objective of this study. For that, semen of 10 Nelore Bulls, used on in-vitro embryo production were submitted (POST) or not (PRE) to a Percoll® gradient. Sperm motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA) and sperm plasmatic membrane integrity (PI), mitochondrial membrane potential (JC1) by Flow Cytometry. Sperm capacitation was evaluated by chlortetracycline fluorescence assay (CTC) and zinc assay with fluorescence probe FluoZinTM -3 AM (FZ3). Finally, in vitro embryo production was performed using seminal samples submitted to the Percoll® gradient. A correlation between cleavage rate, blastocyst rate and the embryo development rate with the sperm capacitation variables was performed. Semen not submitted to Percoll® gradient presented higher percentage of capacitated sperm, higher percentage of reacted spermatozoa in CTC evaluation, and higher percentage of sperm with rectilinearity when compared to sperm submitted to Percoll® gradient. In addition, sperm submitted to Percoll® gradient, had a higher percentage of non-capacitated cells when compared to sperm not submitted to Percoll® gradient. We observed a negative correlation between sperm Zinc signature (3 and 4) that indicate capacitated cells and in-vitro embryo development rate, showing that the more capacitated cells, less embryos are produced. Percoll® gradient removes sperm already capacitated from samples, confirmed by the presence of non-capacitated spermatozoa after submitting sperm to Percoll® gradient. This condition seems to be important for bovine in-vitro fertilization and subsequently success of bovine in-vitro embryo production.

RETORNO REPRODUTIVO DE FÊMEAS DE TAMBAQUI E QUALIDADE ESPERMÁTICA DE MACHOS ENDOGÂMICOS DE TILÁPIA-DO-NILO

O tambaqui é uma espécie reofílica, sendo que em seu ambiente natural precisa realizar piracema para que sua reprodução ocorra, enquanto na piscicultura para que a reprodução ocorra é necessário a utilização de indutores. A tilápia-do-Nilo possui vantagens reprodutivas quando relacionada a outras espécies de peixes, por apresentar maturação sexual precoce e capacidade de se reproduzir durante todo o ano em condições ambientais favoráveis. O objetivo do estudo foi avaliar a reprodução induzida de fêmeas de Colossoma macropomum no início do período reprodutivo e após 75 dias da primeira desova, e comparar as características espermáticas de diferentes grupos genéticos de tilápias-do-Nilo em três coletas com intervalo de 30 dias. Experimento 1: Foram utilizadas oito fêmeas com médias de peso de 6,7 kg e quatro anos de idade. Foi realizada uma indução hormonal no início do período reprodutivo (outubro) e outra após 75 dias da primeira desova (dezembro), sendo avaliados as características reprodutivas das fêmeas nestes dois momentos. Das oito fêmeas que desovaram na primeira indução reprodutiva, três fêmeas (37,5%) desovaram novamente após 75 dias. Todas as características avaliadas foram semelhantes nas duas desovas, exceto a taxa de fertilização que foi menor (P<0,05) na segunda desova. A maioria das fêmeas (66,7%) que desovaram novamente (2ª vez) após 75 dias apresentaram valores superiores à primeira indução hormonal para todas as características avaliadas, exceto para taxa de fertilização. Concluímos que é possível obter retorno reprodutivo de fêmeas de C. macropomum após 75 dias da primeira desova induzida. Experimento 2: Foram utilizados 30 exemplares de tilápia-do-Nilo (500 g), divididos em três grupos, sendo: (i) grupo com 10 peixes endogâmicos (AquaAmérica irmãos completos, consanguinidade de 25% dos pais); (ii) grupo com 10 peixes não endogâmicos (AquaAmérica sem ancestrais comuns até a terceira geração), com consanguinidade no máximo igual a 2%, sem nenhum bisavô comum dos pais; (iii) grupo com 10 peixes heterose (AquaAmérica X GIFT) cruzamento dos pais. Foram avaliadas as características seminais pelo sistema computadorizado (Sperm Class Analyzer), integridade de membrana e atividade mitocondrial. Não houve diferença significativa entre as características espermática entre os grupos genéticos nas diferentes coletas, exceto para a frequência de batimento cruzado (BCF) na primeira coleta. Na comparação de das coletas de cada grupo genético, apenas BCF no grupo AquaAmérica endogâmico diferiu significativamente (P<0,05), com maior valor na coleta 3 (7,7 Hz) em relação a coleta 2 (6,86 Hz). Com relação a integridade da membrana e atividade mitocondrial, apenas a porcentagem de membrana plasmática lesada com alto potencial mitocondrial no grupo genético AquaAmérica endogâmica foi menor (P<0,05) na coleta 2 (0,29%) em relação as coletas 1 (8,34%) e 3 (8,72%); a membrana plasmática integra com alto potencial mitocondrial no grupo AquaAmérica não endogâmica que foi maior (P<0,05) na coleta 2 (27,1%) em relação a coleta 1 (2,97) e 3 (1,72) e no grupo AquaAmérica x GIFT que foi maior (P<0,05) na coleta 2 (68,02%) em relação as coletas 1 (6,19%) e 3 (5,79%). Conclui-se que a variedade AquaAmérica não endogâmica apresenta melhores valores para a variável BCF na primeira coleta, variável que apresenta comportamento distinto entre o grau de endogamia da variedade AquaAmérica ao logo das coletas, inclusive com grande contraste entre a integridade da membrana e atividade mitocondrial entre as coletas.

The tambaqui is a rheophilic species that must perform the piracema (swimming upstream to lay eggs) to reproduce, when in its natural environment. In fish farming, however, inducers must be used for its reproduction to occur. Compared to other fish species, Nile tilapia has reproductive advantages provided by its early sexual maturation and ability to reproduce throughout the year in favorable environmental conditions. The objective of this study was to examine the induced reproduction of Colossoma macropomum females at the beginning of the reproductive period and 75 days after the first spawning, as well as to compare the sperm characteristics of different genetic groups of Nile tilapia in three collections spaced 30 days apart. Experiment 1: eight 4-year-old females with an average weight of 6.7 kg underwent hormonal induction at the beginning of the reproductive period (October) and again 75 days after the first spawning (December). Reproductive traits of the females were evaluated on these two occasions. Of the eight females that spawned in the first reproductive induction, three (37.5%) spawned again after 75 days. All evaluated traits were similar in both spawns, except fertilization rate, which was lower (P<0.05) in the second spawn. Most females (66.7%) that spawned again (2nd time) after 75 days showed higher values than in the first hormonal induction for all evaluated traits, except fertilization rate. We concluded that return to reproduction in C. macropomum females can be achieved 75 days after the first induced spawning. Experiment 2: thirty specimens of Nile tilapia (500 g) were divided into three groups: (i) 10 inbred fish (AquaAmérica full-sibs, 25% inbreeding from parents); (ii) 10 non-inbred fish (AquaAmérica with no common ancestors up to the third generation, with inbreeding of at most 2%, without any common great-grandparent between parents); and (iii) 10 heterozygous fish (AquaAmérica × GIFT parents). Semen characteristics were evaluated in a computerized system (Sperm Class Analyzer) and membrane integrity and mitochondrial activity were analyzed. There was no significant difference in sperm characteristics between the genetic groups in the different collections, except for beat-cross frequency (BCF) in the first collection. When the collections of each genetic group were compared, only BCF in the inbred AquaAmérica group differed significantly (P<0.05), with a higher value observed in collection 3 (7.7 Hz) than in collection 2 (6.86 Hz). As regards membrane integrity and mitochondrial activity, only the percentage of damaged plasma membrane with high mitochondrial potential in the inbred AquaAmérica genetic group was lower (P<0.05) in collection 2 (0.29%) than in collections 1 (8.34%) and 3 (8.72%). Likewise, intact plasma membrane with high mitochondrial potential in the non-inbred AquaAmérica group was higher (P<0.05) in collection 2 (27.1%) than collections 1 (2.97) and 3 (1.72), whereas in the AquaAmérica × GIFT group, it was higher (P<0.05) in collection 2 (68.02%) than collections 1 (6.19%) and 3 (5.79%). In conclusion, BCF values in the non-inbred AquaAmérica variety are better in the first collection. This variable behaves differently according to the degree of inbreeding in the AquaAmérica variety throughout collections, with a marked contrast between membrane integrity and mitochondrial activity between collections.

Maturação espermática durante o trânsito epididimário em um garanhão

Objetivou-se com esse trabalho avaliar in vitro a capacidade fecundante de espermatozoides obtidos nas diferentes porções dos epidídimos de um garanhão, por meio das avaliações físicas e morfológicas do sêmen e de testes complementares dos mesmos. Foi constatada a presença de espermatozoides viáveis e com membrana espermática íntegra ao longo do epidídimo, porém, apenas aqueles obtidos da cauda do epidídimo apresentaram motilidade total significativa e com potencial fecundante. Verificou-se que os valores baixos de células reativas e altos valores para células lesadas e valores de anomalias de cauda (CFD e DG), indicaram baixa integridade funcional de membrana plasmática.

The aim of this study was to assess the in vitro fertilization capacity of equine epididymal spermatozoa, by morphological assessment of semen and complementary tests. The presence of live spermatozoa and with intact spermatic membranes through the entire epididymis were found, but only those found in the epididymis cauda showed significantly total motility and with fertilizing potential. It was observed that low values of reactive cells, high values of injured cells and defects in cauda cells, indicated low plasmatic membrane functional integrity.

Maturação espermática durante o trânsito epididimário em um garanhão

Objetivou-se com esse trabalho avaliar in vitro a capacidade fecundante de espermatozoides obtidos nas diferentes porções dos epidídimos de um garanhão, por meio das avaliações físicas e morfológicas do sêmen e de testes complementares dos mesmos. Foi constatada a presença de espermatozoides viáveis e com membrana espermática íntegra ao longo do epidídimo, porém, apenas aqueles obtidos da cauda do epidídimo apresentaram motilidade total significativa e com potencial fecundante. Verificou-se que os valores baixos de células reativas e altos valores para células lesadas e valores de anomalias de cauda (CFD e DG), indicaram baixa integridade funcional de membrana plasmática. (AU)

The aim of this study was to assess the in vitro fertilization capacity of equine epididymal spermatozoa, by morphological assessment of semen and complementary tests. The presence of live spermatozoa and with intact spermatic membranes through the entire epididymis were found, but only those found in the epididymis cauda showed significantly total motility and with fertilizing potential. It was observed that low values of reactive cells, high values of injured cells and defects in cauda cells, indicated low plasmatic membrane functional integrity. (AU)

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

Oxygen tension and oocyte density during in vitro maturation affect the in vitro fertilization of bovine oocytes / A tensão de oxigênio e a densidade de oócitos durante a maturação in vitro afeta a fecundação in vitro de oócitos bovinos

Oocyte maturation is the key factor affecting the fertilization and embryonic development. Factors such as oocyte density and oxygen tension can directly influence the IMV. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of the association of oxygen tensions (5% or 20%) with different oocyte densities (1:10μl or 1:20μl) in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on maturation and fertilization rates, ROS production and antioxidant activity. Three experiments were performed with bovine oocytes that were obtained from slaughterhouse ovaries. After selection, the oocytes were randomly distributed in four treatments: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5%and 1:20/20% for each experiment. In experiment I, nuclear maturation status and cytoplasmic maturation were evaluated through detection of the first polar body by immunofluorescence and the mitochondrial reorganization assay. In experiment II, ROS production and antioxidant activity were analyzed in oocytes and IVM medium after 24 h of maturation through detection of ROS, reduced glutathione (GSH) and Superoxide dismutase activity by spectrofluorimetric methods. In experiment III, fertilization was evaluated through pronucleus formation, sperm penetration with or without decondensation and polyspermy rates by immunofluorescence. In experiment I, the nuclear maturation and cytoplasmic maturation were similar among treatments (P>0.05). In experiment II, reactive oxygen species in oocytes were elevated in treatments with low oxygen tension which was independent of oocyte density (P<0.05). Additionally, ROS levels in IVM medium were higher in treatments with high oocyte density by volume of medium, which was independent of oxygen tension (P<0.05). In Experiment III, the fertilization and penetration rates were higher in the treatment with 20% oxygen tension and high oocyte density (P<0.05). (AU)

A maturação dos oócitos é o fator chave que afeta a fecundação e o desenvolvimento embrionário. Fatores como a densidade de oócitos e a tensão de oxigênio podem influenciar diretamente a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da associação da tensão de oxigênio (5% ou 20%) com diferentes densidades de oócitos (1:10μl ou 1:20μl) MIV de oócitos bovinos, na taxa de maturação, fecundação, produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e defesas antioxidantes. Três experimentos foram conduzidos com oócitos obtidos de ovários de abatedouro. Após a seleção, os oócitos foram distribuídos homogeneamente em quatro tratamentos: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5% e 1:20/20%. No experimento I, o status da maturação nuclear e citoplasmática foram avaliados pela detecção do primeiro corpúsculo polar por epifluorescência e avaliação da reorganização das mitocôndrias. No experimento II, a produção de EROs e atividade antioxidante foram analisadas nos oócitos e no meio de MIV após 24h de maturação pela detecção de ROS, redução da glutationa (GSH) e atividade da Superoxido Dismutase por métodos de espectrofluorometria. No experimento III, foram avaliadas as taxas de fecundação pela formação dos pro-núcleos, penetração com ou sem descondensação espermática e poliespermia por epifluorescência. No experimento I, a maturação nuclear e citoplasmática foi similar entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, os níveis de ROS nos oócitos foram elevados nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%) independente da densidade de oócitos (P<0,05). Adicionalmente os níveis de ROS no meio de MIV foram maiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos por volume de meio, independente da tensão de oxigênio (P<0,05). No experimento III, a taxa de fecundação e penetração espermática foi maior nos tratamentos com 20% de oxigênio e alta densidade de oócitos (P<0,05).(AU)

Oxygen tension and oocyte density during in vitro maturation affect the in vitro fertilization of bovine oocytes / A tensão de oxigênio e a densidade de oócitos durante a maturação in vitro afeta a fecundação in vitro de oócitos bovinos

Oocyte maturation is the key factor affecting the fertilization and embryonic development. Factors such as oocyte density and oxygen tension can directly influence the IMV. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of the association of oxygen tensions (5% or 20%) with different oocyte densities (1:10μl or 1:20μl) in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on maturation and fertilization rates, ROS production and antioxidant activity. Three experiments were performed with bovine oocytes that were obtained from slaughterhouse ovaries. After selection, the oocytes were randomly distributed in four treatments: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5%and 1:20/20% for each experiment. In experiment I, nuclear maturation status and cytoplasmic maturation were evaluated through detection of the first polar body by immunofluorescence and the mitochondrial reorganization assay. In experiment II, ROS production and antioxidant activity were analyzed in oocytes and IVM medium after 24 h of maturation through detection of ROS, reduced glutathione (GSH) and Superoxide dismutase activity by spectrofluorimetric methods. In experiment III, fertilization was evaluated through pronucleus formation, sperm penetration with or without decondensation and polyspermy rates by immunofluorescence. In experiment I, the nuclear maturation and cytoplasmic maturation were similar among treatments (P>0.05). In experiment II, reactive oxygen species in oocytes were elevated in treatments with low oxygen tension which was independent of oocyte density (P<0.05). Additionally, ROS levels in IVM medium were higher in treatments with high oocyte density by volume of medium, which was independent of oxygen tension (P<0.05). In Experiment III, the fertilization and penetration rates were higher in the treatment with 20% oxygen tension and high oocyte density (P<0.05).

A maturação dos oócitos é o fator chave que afeta a fecundação e o desenvolvimento embrionário. Fatores como a densidade de oócitos e a tensão de oxigênio podem influenciar diretamente a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da associação da tensão de oxigênio (5% ou 20%) com diferentes densidades de oócitos (1:10μl ou 1:20μl) MIV de oócitos bovinos, na taxa de maturação, fecundação, produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e defesas antioxidantes. Três experimentos foram conduzidos com oócitos obtidos de ovários de abatedouro. Após a seleção, os oócitos foram distribuídos homogeneamente em quatro tratamentos: 1:10/5%; 1:10/20%; 1:20/5% e 1:20/20%. No experimento I, o status da maturação nuclear e citoplasmática foram avaliados pela detecção do primeiro corpúsculo polar por epifluorescência e avaliação da reorganização das mitocôndrias. No experimento II, a produção de EROs e atividade antioxidante foram analisadas nos oócitos e no meio de MIV após 24h de maturação pela detecção de ROS, redução da glutationa (GSH) e atividade da Superoxido Dismutase por métodos de espectrofluorometria. No experimento III, foram avaliadas as taxas de fecundação pela formação dos pro-núcleos, penetração com ou sem descondensação espermática e poliespermia por epifluorescência. No experimento I, a maturação nuclear e citoplasmática foi similar entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, os níveis de ROS nos oócitos foram elevados nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%) independente da densidade de oócitos (P<0,05). Adicionalmente os níveis de ROS no meio de MIV foram maiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos por volume de meio, independente da tensão de oxigênio (P<0,05). No experimento III, a taxa de fecundação e penetração espermática foi maior nos tratamentos com 20% de oxigênio e alta densidade de oócitos (P<0,05).

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES UTILIZANDO-SE SÊMEN SEXADO DE TOUROS 5/8 GIROLANDO

title>Abstract /title> p>We evaluated the "in italic>vitro" /italic> blastocyst rate production using bovine sexed semen. Semen from three bulls was used to verify the individual's semen variation, cleavage rates and embryo production. In this study, we employed reproductive biotechnologies, computer analysis of post-thawed semen and fluorescent probes for sperm cells integrity analysis (plasma membrane, acrosome membrane and mitochondrial potential). A total of 959 oocysts went through in vitro maturation steps for in vitro fertilization and cultivation, being 473 with sexed semen and 486 with conventional semen. The cleavage rate was observed in blastocysts on D2 and D7. Data were analyzed by SPSS 16.0 software using analysis of variance (ANOVA), Student's t-test was used to detect differences between groups, and chi-square analysis for in vitro production results (P 0.05 ). The results differed between conventional (31.06%) and sexed semen (21.10%) in the obtainment of blastocyst. When the blastocyst production was individually compared in sexed semen samples (27.69%, 17.93% and 25.56%, bulls 1, 2 and 3, respectively) we verified T2 T1 and T1 = T3 and T2 = T3. As for sperm kinetic analyzes, the sexed semen samples showed differences among bulls in curvilinear speed, linear speed and path velocity variables where T1 (117.7 ± 1.6 µm/s; 60.0 ± 0.3 µm/s, 73.6 ± 0.4 µm/s, respectively) showed the highest values when compared to T2 bulls (80.2 ± 2.3 µm/s, 47.0 ± 2.0 µm/s, 57.7 ± 0, 9 µm/s, respectively) and T3 (86.4 ± 5.7 µm/s, 46.2 ± 2.7 µm/s, 53.8 ± 2.8 µm/s, respectively). Analyses of sperm cell integrity did not differ among conventional semen samples, but in the sexed semen, membrane integrity was the variable that differ statistically among bulls once T1 (38 ± 2.7) differed from T3 (53 8 ± 1.8) (P = 0.009) but did not differ from T2 (44.1 ± 4.4). It is possible to conclude that sexed semen was less efficient in blastocyst production when compared with conventional semen. Analyses of kinetic and integrity were consistent with the fertilization potential of semen samples from 5/8 Girolando bulls. /p>

title>Resumo /title> p>Avaliou-se a taxa de produção de blastocisto italic>"in vitro" /italic>utilizando-se o sêmen bovino sexado. Foram utilizados três reprodutores para verificar a variação individual do sêmen, taxas de clivagem e produção embrionária. O trabalho utilizou-se de biotécnicas reprodutivas, análise computadorizada do sêmen pós-descongelação e sondas fluorescentes para análises de integridade da célula espermática (membrana plasmática, membrana acrossomal e potencial mitocondrial). Um total de 959 oócitos passou por etapas de maturação italic>in vitro, /italic> fertilização italic>in vitro /italic> (sexado, n= 473; convencional, n = 486) e cultivo italic>in vitro /italic>. A taxa de clivagem foi observada no D2 e a de blastocistos no D7. Os dados foram analisados pelo programa SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA), sendo o teste t-Student usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado para análise dos resultados da produção italic>in vitro /italic>(P 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06%) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparada a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3, respectivamente), percebeu-se que T2 T1 e T1=T3 e T2=T3. Quanto às análises de cinética espermática, as amostras de sêmen sexado mostraram diferenças entre os touros nas variáveis velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade do trajeto em que o T1(117,7±1,6 µm/s; 60,0±0,3 µm/s; 73,6±0,4 µm/s, respectivamente) quando comparado aos touros T2 (80,2±2,3 µm/s; 47,0±2,0 µm/s; 57,7±0,9 µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7 µm/s; 46,2±2,7 µm/s; 53,8±2,8 µm/s, respectivamente) obteve valores mais elevados. As análises da integridade da célula espermática não diferiram entre as amostras de sêmen convencional, já no sêmen sexado a integridade de membrana foi a variável que diferiu estatisticamente entre os touros, em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3(53,8± 1,8) (P=0,009), mas não divergiu do T2 (44,1±4,4). É possível concluir que o sêmen sexado foi menos eficiente na produção de blastocisto quando comparado ao sêmen convencional. As análises de cinética e de integridade foram compatíveis com o potencial fertilizante das amostras de sêmen em touros da raça 5/8 Girolando. /p>

IMUNOLOCALIZAÇÃO DA OSTEOPONTINA E ASSINATURAS PROTEÔMICAS DO TRATO REPRODUTOR DE CÃES

Os estudos com a tecnologia ômica auxiliam a investigar o papel da sinalização proteica na maturação espermática, capacitação e fertilização. Apesar da importância de estudos sobre moléculas envolvidas na fertilidade, até o momento, na espécie canina, a proteômica do tecido reprodutor não foi descrita. Dessa forma, o objetivo desse estudo e a imunolocalização da osteopontina em testículo, cabeça, corpo e cauda do epidídimo (Artigo I) e descrever o proteoma destes tecidos (Artigo II). A escolha desta proteína foi devida a importância relacionada a fertilidade já demonstrada em outras espécies. Para realização do artigo I, foram colhidos de 3 cães adultos jovens entre 2 a 5 anos, testículos e epidídimos (cabeça, corpo e cauda), sem raça definida, após a orquiectomia eletiva, totalizando 24 amostras. Para realização do artigo II, testículos e epidídimos (cabeça, corpo e cauda) foram colhidos de 3 cães, adultos jovens entre 2 a 5 anos, amostras armazenadas em formalina tamponada durante 48 horas e transferidas para álcool 70%, as amostras passaram por desidratação e reidratação. Foi utilizado anticorpo anti-OPN, as amostras foram coradas com DAB. Todos os tecidos foram marcados com anticorpo, em células próximas a parte luminal do epidídimo e citoplasma, sem diferença significativa (P>0,05). As amostras foram marcadas em célula próximas a parte luminal do epidídimo e citoplasma. Apesar da imunomarcação da OPN no citoplasma das células, em todos os tecidos, esta proteína não foi identificada na abordagem shotgun. Também não houve diferença na imunomarcação da OPN entre os tecidos. No artigo II, foram encontradas 1.918 proteínas, sendo 132 utilizadas na análise multivariada, a qual incluiu a principal component analysis (PCA), variable importance in projection (VIP score) determinada pela partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), ANOVA, dendrograma e diagrama de Venn. Na PCA foram formados 4 clusters distintos, com proximidade dos clusters das amostras da cabeça e corpo do epidídimo. O VIP score indicou 20 proteínas ( > 1,5) e 18 foram confirmadas pelo ANOVA como mais relevantes nos clusters. Seis proteínas foram mais abundantes no corpo, 4 na cabeça do epidídimo e 10 no testículo. As proteínas inositol-3-phosphate synthase 1, equilibrative nucleoside transporter 1, tubulin alpha chain, heat shock protein 90 alpha family class A member 1, heat shock protein family A member 8, heat shock protein family A (HSP70) member 2 e cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1, tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta foram mais abundantes no testículo e reduziram gradativamente em direção a cauda do epidídimo. Concluímos que a abundância das proteínas nos tecidos do trato reprodutor está relacionada com a função dos compartimentos de cada compartimento, como o testículo, cabeça, corpo e cauda do epidídimo de cão pode possuir alguma proteína similiar a OPN que se ligue ao anticorpo, porém é necessários maiores investigações.

Studies with omic technology help to investigate the role of protein signaling in sperm maturation, capacitation and fertilization. Thus, the objective of this study is the immunolocation of osteopontin in the testis, head, body and cauda of the epididymis (Article I) and to describe the proteome of these tissues (Article II). The choice of this protein was due to the importance related to fertility already demonstrated in other species. Article I, 3 young adult dogs aged 2 to 5 years, testicles and epididymis (caput, corpus and cauda), of mixed breed, were collected after elective orchiectomy, totaling 24 samples. For the realization of article II, testicles and epididymis (caput, corpus and tail) were collected from 3 dogs, young adults aged 2 to 5 years, samples stored in buffered formalin for 48 hours and transferred to 70% alcohol, the samples were dehydrated and rehydration. Anti-OPN antibody was used, the samples were stained with DAB. All tissues were labeled with antibody in cells close to the luminal part of the epididymis and cytoplasm, with no significant difference (P> 0.05). Despite the immunostaining of OPN in the cytoplasm of cells, in all tissues, this protein was not identified in the shotgun approach. There was also no difference in the immunostaining of OPN between tissues. In article II, 1,918 proteins were found, 132 of which were used in multivariate analysis, which included the main component analysis (PCA), variable importance in projection (VIP score) determined by the partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), ANOVA , dendrogram and Venn diagram. In the PCA, 4 distinct clusters were formed, with proximity to the clusters of the head and body samples of the epididymis. The VIP score indicated 20 proteins (> 1.5) and 18 were confirmed by ANOVA as the most relevant in the clusters. Six proteins were more abundant in the body, 4 in the epididymis head and 10 in the testis. Inositol-3-phosphate synthase 1, equilibrative nucleoside transporter 1, tubulin alpha chain, heat shock protein 90 alpha family class A member 1, heat shock protein family A member 8, heat shock protein family A (HSP70) member 2 and cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1, tyrosine 3-monooxygenase / tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta were more abundant in the testis and gradually reduced towards the tail of the epididymis. We conclude that the abundance of proteins in the tissues of the reproductive tract is related to the function of the compartments of each compartment, as the testis, caput, corpus and cauda of the dog epididymis may have some protein similar to OPN that binds to the antibody, however it is urther investigation is needed.

Produção in vitro de embriões utilizando-se sêmen sexado de touros 5/8 Girolando / Production of in vitro embryo using sexed sperm of 5/8 Girolando bulls

We evaluated the "in vitro" blastocyst rate production using bovine sexed semen. Semen from three bulls was used to verify the individual"s semen variation, cleavage rates and embryo production. In this study, we employed reproductive biotechnologies, computer analysis of post-thawed semen and fluorescent probes for sperm cells integrity analysis (plasma membrane, acrosome membrane and mitochondrial potential). A total of 959 oocysts went through in vitro maturation steps for in vitro fertilization and cultivation, being 473 with sexed semen and 486 with conventional semen. The cleavage rate was observed in blastocysts on D2 and D7. Data were analyzed by SPSS 16.0 software using analysis of variance (ANOVA), Student"s t-test was used to detect differences between groups, and chi-square analysis for in vitro production results (P 0.05 ). The results differed between conventional (31.06%) and sexed semen (21.10%) in the obtainment of blastocyst. When the blastocyst production was individually compared in sexed semen samples (27.69%, 17.93% and 25.56%, bulls 1, 2 and 3, respectively) we verified T2 T1 and T1 = T3 and T2 = T3. [...]

Avaliou-se a taxa de produção de blastocisto in vitro utilizando-se o sêmen bovino sexado. Foram utilizados três reprodutores para verificar a variação individual do sêmen, taxas de clivagem e produção embrionária. O trabalho utilizou-se de biotécnicas reprodutivas, análise computadorizada do sêmen pós-descongelação e sondas fluorescentes para análises de integridade da célula espermática (membrana plasmática, membrana acrossomal e potencial mitocondrial). Um total de 959 oócitos passou por etapas de maturação in vitro, fertilização in vitro (sexado, n= 473; convencional, n = 486) e cultivo in vitro. A taxa de clivagem foi observada no D2 e a de blastocistos no D7. Os dados foram analisados pelo programa SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA), sendo o teste t-Student usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado  para análise dos resultados da produção in vitro (P 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06%) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparada a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3, respectivamente), percebeu-se que T2 T1 e T1=T3 e T2=T3. Quanto às análises de cinética espermática, as amostras de sêmen sexado mostraram diferençasentre os touros nas variáveis velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade do trajeto em que o T1(117,7±1,6 µm/s; 60,0±0,3 µm/s; 73,6±0,4 µm/s, respectivamente) quando comparado aostouros T2 (80,2±2,3 µm/s; 47,0±2,0 µm/s; 57,7±0,9 µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7 µm/s; 46,2±2,7 µm/s; 53,8±2,8 µm/s, respectivamente) obteve valores mais elevados. As análises daintegridade da célula espermática não diferiram entre as amostras de sêmen convencional, já no sêmen sexado a integridade de membrana foi a variável que diferiu estatisticamente entre os touros, em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3(53,8± 1,8) (P=0,009), mas não divergiu do T2 (44,1±4,4).[...]

Produção in vitro de embriões utilizando-se sêmen sexado de touros 5/8 Girolando / Production of in vitro embryo using sexed sperm of 5/8 Girolando bulls

We evaluated the "in vitro" blastocyst rate production using bovine sexed semen. Semen from three bulls was used to verify the individual"s semen variation, cleavage rates and embryo production. In this study, we employed reproductive biotechnologies, computer analysis of post-thawed semen and fluorescent probes for sperm cells integrity analysis (plasma membrane, acrosome membrane and mitochondrial potential). A total of 959 oocysts went through in vitro maturation steps for in vitro fertilization and cultivation, being 473 with sexed semen and 486 with conventional semen. The cleavage rate was observed in blastocysts on D2 and D7. Data were analyzed by SPSS 16.0 software using analysis of variance (ANOVA), Student"s t-test was used to detect differences between groups, and chi-square analysis for in vitro production results (P 0.05 ). The results differed between conventional (31.06%) and sexed semen (21.10%) in the obtainment of blastocyst. When the blastocyst production was individually compared in sexed semen samples (27.69%, 17.93% and 25.56%, bulls 1, 2 and 3, respectively) we verified T2 T1 and T1 = T3 and T2 = T3. [...](AU)

Avaliou-se a taxa de produção de blastocisto in vitro utilizando-se o sêmen bovino sexado. Foram utilizados três reprodutores para verificar a variação individual do sêmen, taxas de clivagem e produção embrionária. O trabalho utilizou-se de biotécnicas reprodutivas, análise computadorizada do sêmen pós-descongelação e sondas fluorescentes para análises de integridade da célula espermática (membrana plasmática, membrana acrossomal e potencial mitocondrial). Um total de 959 oócitos passou por etapas de maturação in vitro, fertilização in vitro (sexado, n= 473; convencional, n = 486) e cultivo in vitro. A taxa de clivagem foi observada no D2 e a de blastocistos no D7. Os dados foram analisados pelo programa SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA), sendo o teste t-Student usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado  para análise dos resultados da produção in vitro (P 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06%) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparada a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3, respectivamente), percebeu-se que T2 T1 e T1=T3 e T2=T3. Quanto às análises de cinética espermática, as amostras de sêmen sexado mostraram diferençasentre os touros nas variáveis velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade do trajeto em que o T1(117,7±1,6 µm/s; 60,0±0,3 µm/s; 73,6±0,4 µm/s, respectivamente) quando comparado aostouros T2 (80,2±2,3 µm/s; 47,0±2,0 µm/s; 57,7±0,9 µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7 µm/s; 46,2±2,7 µm/s; 53,8±2,8 µm/s, respectivamente) obteve valores mais elevados. As análises daintegridade da célula espermática não diferiram entre as amostras de sêmen convencional, já no sêmen sexado a integridade de membrana foi a variável que diferiu estatisticamente entre os touros, em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3(53,8± 1,8) (P=0,009), mas não divergiu do T2 (44,1±4,4).[...](AU)