Comparative morphometric evaluation of hepatic hemosiderosis in wild Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) infected with different Plasmodium spp. subgenera / Avaliação morfométrica comparativa da hemossiderose hepática em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) de vida livre infectados por diferentes subgêneros de Plasmodium spp

Avian malaria is one of the most important diseases of captive penguins. We employed morphometric techniques to evaluate hepatic hemosiderosis in rehabilitating wild Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) that were negative (n = 9) or naturally infected by different subgenera of Plasmodium spp. (n = 24), according with: Plasmodium subgenera (Haemamoeba, Huffia, Other lineages, and Unidentified lineages), severity of Plasmodium histopathological lesions, and concurrent diseases, age class (juvenile or adult plumage), sex (male, female or not determined), body score (emaciated, thin, good, excellent, not available), molt, presence or absence of oil contamination upon admission, iron supplementation, and rehabilitation center. The percentage of the area occupied by hemosiderin was called Index of Hepatic Hemosiderosis (IHH). Plasmodium-positive females presented significantly higher IHH values (17.53 ± 12.95%) than males (7.20 ± 4.25%; p = 0.041). We observed higher levels of congestion (p = 0.0182) and pneumonia (p = 0.0250) severity between Unidentified lineages vs. Huffia. We believe that the hepatic hemosiderosis observed in this study was multifactorial, the result of pathological processes caused by malaria, molting, hemoglobin and myoglobin catabolism during migration, anemia, concomitant diseases, and iron supplementation, all possibly potentiated by decreased liver mass. Further studies are needed to clarify the mechanisms of these hypotheses.(AU)

Malária aviária é uma das mais relevantes doenças em pinguins cativos. Foram aplicadas técnicas morfométricas para avaliar a hemossiderose hepática em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus ) de vida livre em reabilitação negativos (n = 9) e naturalmente infectados por diferentes subgêneros de Plasmodium spp. (n = 24), quanto a: subgênero de Plasmodium (Haemamoeba , Huffia, Outras Linhagens, e Linhagens não identificadas), severidade das lesões histopatológicas causadas por Plasmodium e doenças concomitantes, faixa etária (plumagem juvenil ou adulta), sexo (macho, fêmea, indeterminado), condição corporal (emaciado, magro, bom, excelente, indisponível), muda, presença/ausência de óleo a admissão, suplementação de ferro, e centro de reabilitação. A porcentagem da área ocupada por hemossiderina foi denominada Índice de Hemossiderose Hepática (IHH). Fêmeas Plasmodium -positivas apresentaram IHH significativamente mais elevado que machos, respectivamente, 17,53 ± 12,95% e 7,20 ± 4,25% (p = 0,041). Níveis mais elevados de congestão (p = 0,0182) e pneumonia (p = 0,0250) foram observados entre Linhagens não identificadas vs. Huffia. Possivelmente, a hemossiderose hepática observada nesse estudo seja multifatorial, resultado de processos patológicos causados por malária, muda, catabolismo de hemoglobina e mioglobina durante a migração, anemia, doenças concomitantes e suplementação de ferro, potencialmente intensificados por massa hepática reduzida. Estudos complementares são necessários para esclarecer os mecanismos de tais hipóteses.(AU)

OCORRÊNCIA DE PLASMODIUM SPP. E HAEMOPROTEUS SPP. EM AVES NO ESTADO DO PIAUÍ.

As infecções por hemosporídeos aviários especialmente Haemoproteus spp. e Plasmodium spp são consideradas importantes fatores de declínio populacional e extinção de espécies, os estudos destas infecções em aves podem levar ao entendimento de relações entre parasitas, hospedeiros e ambiente. O Brasil apresenta a maior avifauna no mundo e vários estudos foram realizados no país para entender fatores ecológicos e epidemiológicos destas infecções. O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de hemosporídeos em aves no Estado do Piauí. Foram capturadas aves nos seguintes municípios do Estado: Água Branca, Amarante, Lagoa Alegre, Parnaíba, Piripirí e Teresina. As capturas foram realizadas utilizando rede de neblina e pulsar;As aves foram avaliadas morfometricamente e realizou-se coleta de sangue para avaliação hematológica e amostras para realização de análise molecular. Hemosporídeos foram detectados em 6,71% (51/371) na avaliação por microscopia de luz e 24,4% (24/102) na avaliação molecular. A Reação em Cadeia da Polimerase foi mais eficiente que a microscopia na detecção de hemosporíodeos pelo teste qui quadrado (P0,05). A infecção foi relatada pela primeira vez em cinco hospedeiros Certhiaxis cinnamomeus (Curutié), Agelaioides fringillarius (Asa de Telha Pálido), Furnarius figulos (Casaco de Couro na Lama), Calidris minutilla (Maçariquinho) e Conirostrum bicolor (Figuinha do Mangue). Os resultados demonstram que as infecções por hemosporídeos ocorrem em aves do Estado do Piauí, o diagnóstico molecular é mais eficiente que o diagnóstico microscópico nestas infecções e novos hospedeiros participam do ciclo destas infecções no estado.

Avian hemoporid infections, especially Haemoproteus spp. and Plasmodium spp are considered important factors of population decline and species extinction, studies carried out in birds can lead to an understanding of the relationships between parasites, hosts and environment. Brazil has the largest birds diversity in the world and several studies have been carried out in the country for ecological and epidemiological factors. The aim of this study was to evaluate the occurrence of this hemoporidae in birds in the state of Piauí. Birds were captured in the municipalities of Água Branca, Amarante, Lagoa Alegre, Parnaíba, Piripirí and Teresina in the State of Piauí. The captures were carried out using the mist net and pulsar, the birds were evaluated morphometrically and blood was collected for hematological evaluation and carried out for molecular analysis. Hemosporidia were detected in 6.71% (51/371) in the light microscopy evaluation and 24.4% (24/102) in the molecular evaluation. (P0.05). Infection was reported for the first time in five hosts Certhiaxis cinnamomeus, Agelaioides fringillarius, Furnarius figulos, Calidris minutilla and Conirostrum bicolor. The results demonstrate that alterations caused by hemoporids occur in birds in the state of Piauí, molecular diagnosis is more efficient than microscopic diagnosis, and new hosts participate in the disease cycle in the state.

Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection in birds of the Brazilian Atlantic Forest detected by microscopy and polymerase chain reaction / Infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. em aves da Mata Atlântica brasileira detectada por microscopia e reação em cadeia da polimerase

In recent years haemosporidian infection by protozoa of the genus Plasmodium and Haemoproteus, has been considered one of the most important factors related to the extinction and/or population decline of several species of birds worldwide. In Brazil, despite the large avian biodiversity, few studies have been designed to detect this infection, especially among wild birds in captivity. Thus, the objective of this study was to analyze the prevalence of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection in wild birds in captivity in the Atlantic Forest of southeastern Brazil using microscopy and the polymerase chain reaction. Blood samples of 119 different species of birds kept in captivity at IBAMA during the period of July 2011 to July 2012 were collected. The parasite density was determined based only on readings of blood smears by light microscopy. The mean prevalence of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection obtained through the microscopic examination of blood smears and PCR were similar (83.19% and 81.3%, respectively), with Caracara plancus and Saltator similis being the most parasitized. The mean parasitemia determined by the microscopic counting of evolutionary forms of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. was 1.51%. The results obtained from this study reinforce the importance of the handling of captive birds, especially when they will be reintroduced into the wild.(AU)

Nos últimos anos infecção por protozoários hemosporídeos dos gêneros Plasmodium e Haemoproteus, tem sido considerada um dos fatores mais importantes relacionados com a extinção e / ou declínio da população de várias espécies de aves em todo o mundo. No Brasil, apesar da grande biodiversidade aviária, poucos estudos foram desenvolvidos para detectar a infecção, especialmente entre as aves silvestres mantidas em cativeiro. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a prevalência de infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. em aves silvestres em cativeiro na Mata Atlântica do sudeste do Brasil, utilizando microscopia convencional e reação em cadeia da polimerase. Amostras de sangue de 119 aves mantidas em cativeiro no Ibama durante o período de julho de 2011 a julho de 2012, foram coletadas. A densidade parasitária foi determinada com base apenas em leituras de esfregaços de sangue por microscopia fotônica. A prevalência média de infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. obtida por exame microscópico de esfregaços sanguíneos e PCR foi semelhante (83,19% e 81,3%, respectivamente), com Caracara plancus e Saltator similis sendo as espécies mais parasitadas. A parasitemia média determinada pela contagem microscópica de formas evolutivas de Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. foi de 1,51%. Os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância do manejo de aves em cativeiro, especialmente quando serão reintroduzidas na natureza.(AU)

Avaliação morfométrica da hemossiderose e necrose hepática em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) naturalmente infectados por Plasmodium spp

Durante sua migração invernal, pinguins-de-Magalhães permanecem na plataforma continental brasileira. Neste este período, animal debilitados e/ou doentes são encaminhados a centros de reabilitação ao longo da costa do Brasil. Durante a estadia nesses centros, essas aves podem desenvolver malária aviária, doença causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida por mosquitos vetores. Hemossiderose e necrose hepáticas já foram descritas em casos de malária aviária. Nesse estudo foram utilizadas técnicas morfométricas para avaliar a hemossiderose e necrose em lâminas de cortes histológicos de fígado de pinguins-de-Magalhães naturalmente infectados por Plasmodium spp. e nove pinguins-de-Magalhães comprovadamente negativos para Plasmodium spp. (grupo Plasmodium-negative), utilizando as colorações de Perls e reticulina. Todos os animais utilizados nesse estudo foram mantidos sob as mesmas condições de manejo. Linhagens de Plasmodium spp. haviam sido previamente identificadas por esfregaço sanguíneo e/ou análise filogenética do gene cyt-b mitocondrial.O objetivo desse estudo foi avaliar a significância dos quadros de hemossiderose e necrose em pinguins-de-Magalhães infectados por Plasmodium spp. e entre as linhagens/espécies de Plasmodium spp. Fragmentos histológicos foram analisados sob microscópio equipado com um sistema digital de análise de imagens. Foi realizada captura fotográfica do centro de cada fragmento hepático, seguido por 8 capturas adicionais a 50 µm do centro da lâmina, a intervalos de 45°, sob as mesmas condições de luminosidade. Áreas de hemossiderose e necrose foram semi-automaticamente delineadas, sob zoom máximo de 50%. A porcentagem das áreas ocupadas pela hemossiderina e fibras reticulares foram consideradas, respectivamente, como Índice de Hemossiderose Hepática (IHH) e Índice de Necrose Hepática (IHN). O IHN do grupo Plasmodium-negative foi significativamente maior que o IHN do grupo positivo (p>0.001). Entretanto, não foi observada diferença entre o IHH dos dois grupos. Diferenças significativas também não foram observadas no IHH e IHN em relação a instituição, idade, sexo, contaminação por óleo, ou linhagem/espécie de Plasmodium (p>0,05). Não foram observadas correlações significativas entre o IHH e o IHN quanto ao período total de estadia em centro de reabilitação ou período de estadia em centro de reabilitação durante o verão (período de maior densidade do mosquito/vetor) (p>0.05). Hemossiderose hepática possivelmente foi causada por outros fatores, tais como alterações fisiológicas sazonais, ações antropogênicas e alterações climáticas levando a anorexia/caquexia e técnicas de manejo e suplementação durante a reabilitação. Necrose hepática foi significativa entre ambos os grupos, o que pode ter ocorrido devido a uma possível relação entre esta patologia e Plasmodium spp. (por ex: hipóxia causada por obstrução mecânica da vascularização hepática, vasculite parasitária ou presença de nematódeos gastrointestinais) ou à presença de autólise hepática, levando a quadro histológico semelhante à necrose quando avaliada sob coloração de reticulina. A malária aviária é uma das mais importantes afecções de cativeiro em pinguins, podendo comprometer seriamente a reabilitação de pinguins-de-Magalhães. Estudos futuros são necessários para esclarecer os mecanismos dessas hipóteses.

While foraging on the Brazilian continental shelf during winter migration, sick and/or debilitated Magellanic Penguins (Spheniscus magellanicus) found ashore are directed to rehabilitation centers along the coast. While under care, these birds may develop avian malaria, a mosquito-transmitted disease caused by protozoans of the genus Plasmodium. Hepatic hemosiderosis and necrosis have been previously described in avian malaria. We used morphometric techniques to evaluate hemosiderosis and necrosis in Perls- and reticulin-stained liver samples from 24 Magellanic penguins naturally infected by Plasmodium spp. and nine Plasmodium-negative Magellanic penguins (Plasmodium-negative group). All birds were kept under similar housing and husbandry regimens. Plasmodium lineages had been identified through blood smear morphology and/or phylogenetic analysis of the mitochondrial cyt-b gene. Our goal was to evaluate the significance of hepatic hemosiderosis and necrosis in Magellanic penguins infected with Plasmodium sp. and between Plasmodium lineages/species. Histological sections were analyzed under a microscope equipped with a digital system for image analysis. A high power-field of the center of each sample was captured, and eight additional images were captured 50 µm from this point, at 45°intervals, under the same lighting conditions. Areas of hemosiderin and reticulin fibers were semi-automatically outlined, under a maximum zoom of 50%. The percentage of the area occupied by hemosiderin and reticular fibers were respectively considered the index of hepatic hemosiderosis (IHH) and index of hepatic necrosis (IHN). IHN was significantly higher in the Plasmodium-negative group in comparison with the positive group (p<0.001), however, no difference was detected between the IHH of both groups. Significant differences were not detected between IHH and INH regarding institution, age, sex, oil contamination, and Plasmodium lineages/species (p>0.05). There were also no correlation between IHH and IHN regarding the total period of stay in the rehabilitation center or period of stay in the rehabilitation center during summer (period of highest mosquito/vector density) (p>0.05). Hepatic hemosiderosis was possibly related to other causes, such as seasonal physiological changes, anthropogenic disturbance and climatic changes leading to starvation, and husbandry and iron supplementation while under care. Hepatic necrosis was significant between both groups, suggesting a possible relationship between this pathology and Plasmodium spp. (e.g., hypoxia due to mechanic obstruction of the hepatic vasculature, parasitic vasculitis leading to hepatic necrosis, or presence of gastrointestinal nematodes) or the presence of hepatic autolysis, leading to histopathologic changes similar to hepatic necrosis whaen evaluated with reticulin staining. Avian malaria is one of the most important diseases of captive penguins, and may seriously compromise the rehabilitation of Magellanic penguins. Further studies are still needed to clarify the mechanisms of these hypotheses

Identificação e caracterização molecular das espécies de Plasmodium sp. em Spheniscus magellanicus (Sphenisciformes: Spheniscidae) resgatados no litoral do Rio de Janeiro.

A movimentação de patógenos entre aves domésticas e selvagens ainda permanece um tema repleto de incertezas. Isto pode representar um perigo em potencial não só para a avicultura comercial, mas para a conservação de espécies selvagens que não estejam adaptadas a estes patógenos. Ambientalistas tem mostrado que a população natural de pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus Foster 1781) vem diminuindo drasticamente, a ponto de tornar essas aves potencialmente ameaçadas. Sazonalmente os pinguins-deMagalhães migram em busca de alimento na plataforma continental brasileira e alguns indivíduos encalham em áreas costeiras nacionais. Debilitados, adquirem doenças que contribuem para o baixo sucesso na reabilitação, com destaque para a malária aviária. Embora recuperados clinicamente, estes animais podem se tornar reservatórios para a doença de modo que podem representar riscos de transmissão para outras aves. Para a malária aviária, a padronização de novas técnicas que enalteçam a real sensibilidade da biologia molecular se faz necessária. Assim, o objetivo do presente é detectar a ocorrência de Plasmodium sp., caracterizando, por técnicas moleculares, as espécies envolvidas e seus genótipos. Foram coletadas amostras de sangue de cento e sete pinguins-de-Magalhães em reabilitação na Clínica de Recuperação de Animais Silvestres em Vargem Pequena, RJ, as quais cinquenta foram encaminhadas para diagnóstico molecular e sequenciamento para a determinação das espécies de Plasmodium sp presentes. Foram sequenciadas dez amostras de Plasmodium; duas amostras foram identificadas como Plasmodium gallinaceum, sendo o primeiro registro de infecção por essa espécie de Plasmodium em pinguins-de-Magalhães (S. magellanicus), e uma amostra de uma linhagem semelhante à Plasmodium cathemerium, denominada PADOM09 pelo banco genético MalAvi. As demais amostras, ao serem agrupadas em uma árvore filogenética formaram dois grupos distintos com alta similaridade interna, que não formaram clade com sequências de Plasmodium previamente descritas na literatura. O S. magellanicus, em razão de sua susceptibilidade natural, demonstrou ser uma boa fonte de estudos para se determinar a fauna parasitária local. Por outro lado, diversos protocolos de PCR para a detecção de Plasmodium descritos na literatura não obtiveram amplificação em amostras conhecidamente positivas. No Brasil, apesar de haverem vários estudos em que o diagnóstico molecular de Plasmodium foi realizado, poucos utilizaram o sequenciamento dos parasitas encontrados, de modo que informações sobre a real diversidade de linhagens de Plasmodium aviário no país ainda são escassas.

The dissemination of pathogens between domestic and wild birds still remains a topic full of uncertainties. This may represent a potential danger not only for the commercial poultry industry, but for the conservation of wild species that are not adapted to these pathogens. Environmentalists have shown that the natural population of Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus Foster 1781) has decreased dramatically, to the point of making them potentially endangered birds. Every year the Magellanic penguins migrate along the Brazilian continental shelf in search of food, and occasionally some individuals wash ashore in national coastal areas. Debilitated, they usually acquire diseases that contribute to their low success in rehabilitation, especially avian malaria. Although clinically recovered, these animals can become reservoirs for the disease, which may de transmited and therefore could represent a risk for other birds. In case of avian malaria, standardization of new techniques that enhance the sensitivity of diagnostic tools such as molecular biology is required. Thus the objectice of the present study is to detect the presence of Plasmodium sp., characterizing, with molecular techniques, their genotypes and species involved. Blood samples of a hundred and seven Magellanic penguins (S. magellanicus) were collected from the recovering animals in the Clínica de Recuperação de Animais Silvestres in Vargem Pequena, RJ, of which fifty were used for molecular diagnostic and sequencing in order to determine the infecting Plasmodium sp. species. Ten samples were succefully sequenced as Plasmodium; two samples were identified as Plasmodium gallinaceum, which is the first record of this Plasmodium species infecting Magellanic penguins (S. magellanicus), and a single sample identified as a lineage genetically similar to Plasmodium cathemerium, designated PADOM09 by the genebank MalAvi. The remaining samples, when grouped in a phylogenetic tree formed two distinc clades with high internal similarity, and did not group with any of the known Plasmodium lineage samples deposited in genebanks. The S. magellanicus, by reason of their natural susceptibility to this parasite, has shown to be a good source for determining the local parasitic fauna. On the other hand, several PCR protocols for the detection of Plasmodium described in literature were not successful in amplifying its DNA in infected samples. In Brasil, despite the publication of several studies utilizing molecular techniques for detecting avian Plasmodium, few sequenced the parasites found. For this reason, data regarding the real diversity of Plasmodium lineages and species are still scarce.

Prevalência, riqueza e sazonalidade de hemosporídeos aviários em diferentes estágios de sucessão ecológica no Parque Estadual da Mata Seca, Minas Gerais, Brasil

Prevalência, riqueza e sazonalidade de hemosporídeos aviários em diferentes estágios de sucessão ecológica no Parque Estadual da Mata Seca, Minas Gerais, Brasil Resumo: Alterações ambientais, como a conversão de habitat para a pecuária, constituem umas das principais causas da perda de biodiversidade. Estes dois fatores em conjunto podem aumentar a exposição de populações animais e humanas a agentes infecto-parasitários. A hemosporidiose aviária, infecção causada por protozoários dos gêneros Plasmodium e Haemoproteus, possui distribuição cosmopolita e provoca diferentes efeitos deletérios em aves de vida livre. Tem sido revelada grande diversidade destes parasitos no Brasil, apontando este sistema parasito-vetor-hospedeiro como um importante modelo para estudos sobre ecologia e evolução de parasitos de relevância conservacionista. A prevalência e diversidade destes parasitos apresentam variações entre ambientes com diferentes níveis de integridade florestal, no entanto, estes parâmetros parasitológicos ainda não haviam sido avaliados em um gradiente de sucessão ecológica no Brasil. O efeito da sazonalidade na prevalência e na distribuição de hemosporídeos não é amplamente explorado em ambientes tropicais. Além disso, pouco se sabe sobre vetores de hemosporídeos no mundo, e menos ainda é conhecido no Brasil. Com isso, o presente trabalho avaliou o efeito da sucessão ecológica e da sazonalidade sobre a comunidade de aves e sobre a prevalência e diversidade de hemosporídeos em aves e em mosquitos no Parque Estadual da Mata Seca, Minas Gerais. Aves foram capturadas com redes de neblina em quatro diferentes estágios sucessionais: pastagem, e estágios inicial, intermediário e tardio. Os três primeiros constituíam áreas de pastagem abandonadas há 8, 13 e 30 anos, respectivamente, e o estágio tardio não apresentava histórico de intervenção humana há mais de 50 anos. O efeito da sazonalidade da Mata Seca na distribuição das aves, mosquitos e de seus parasitos foi avaliado a partir de coletas realizadas em quatro épocas: final do período de chuvas, início e final da estação seca, e pico da estação chuvosa subsequente. Um total de 461 aves foram capturadas, cujas comunidades apresentaram diferenças entre áreas de pastagem e os demais estágios sucessionais. A prevalência de hemosporídeos foi maior entre aves de pastagem em relação às aves dos demais estágios sucessionais considerando toda a comunidade de aves avaliadas. A prevalência também foi maior em aves de espécies exclusivas de áreas de pastagem quando comparadas com espécies que não foram capturadas nesse estágio. Isso revela que espécies exclusivas de áreas de pastagem podem aumentar o risco de infecção por hemosporídeos para espécies que frequentam diversos estágios sucessionais. A prevalência de infecção por hemosporídeos aumentou entre a metade e o final da época seca, podendo indicar um fenômeno conhecido como recaída de primavera, frequente em climas temperados, mas nunca reportado em locais de clima tropical. Também observamos uma distribuição sazonal dos parasitos do subgênero H. (Parahaemoproteus), que só foram detectados durante as épocas de chuva. Identificamos mosquitos das espécies Mansonia titillans e Ma. pseudotitillans como potenciais vetores de Plasmodium spp. após análise por PCR de pools de abdomens. O presente estudo evidencia o papel da sucessão ecológica na estrutura das comunidades das aves. Espécies habitantes de estágios avançados de sucessão são beneficiadas por apresentarem menores taxas de infecção por parasitos patogênicos. Estudos futuros envolvendo coletas periódicas de aves ao longo de vários anos em outros ambientes tropicais sazonais podem revelar se os resultados aqui demonstrados são decorrentes de variações aleatórias ou se realmente refletem alterações sazonais das interações entre hemosporídeos e aves tropicais.

Prevalence, richness and seasonality of avian haemosporidians at different successional stages in Mata Seca State Park, Minas Gerais, Brasil. Abstract: Environmental changes, such as land conversion for livestock farming, constitute the main causes of loss of biodiversity. These effects together can increase parasitic diseases risk in human and wildlife populations. Avian haemosporidian is a worldwide protozoan disease caused by parasites in the genera Plasmodium and Haemoproteus that has varying deleterious effects on free-living birds. Recent studies have revealed a considerable diversity of haemosporidians in Brazil, depicting this parasite-vector-host system as an important model for ecological and evolutionary studies of parasites of conservational value. Patterns in haemosporidian prevalence and diversity change between habitats with different levels of forest integrity. However, such parameters had not been accessed in forest fragments under different stages of ecological succession in Brazil. Little is known about haemosporidian vectors in the world, and even less is understood in Brazil. With that, we accessed the effects of the ecological succession in bird communities and in the prevalence and diversity of haemosporidians in birds and in mosquitos captured in Mata Seca State Park, Minas Gerais, which ecosystem is dominated by Seasonally Dry Tropical Forest. We mist-netted birds in four different successional stages: pasture areas, and early, intermediate, and late stages. The first three stages consisted in pasture areas abandoned 8, 12 and 30 years ago, respectively, and the late stage does not have reports of human intervention for more than 50 years. Seasonal effects on birds, mosquitos and parasite distribution were evaluated by conducting bird and mosquito captures at four periods: end of the rainy season, beginning and end of the dry season, and peak of the following rainy season. We captured 461 birds, which communities changed between pasture areas and the remaining successional stages. Haemosporidian prevalence, as detected by PCR, was higher within birds in pasture compared with birds captured in non-pasture areas when we considered whole communities. Prevalence also was higher within bird species captured exclusively in pasture areas then within species exclusive from non-pasture areas. Our results reveal that species exclusive from pasture areas increase haemosporidian infection risks for species that inhabit different successional stages when they include pasture areas in their range. Haemosporidian prevalence increased between the beginning and the end of the dry season, suggesting a phenomenon known as spring relapse, which has been reported in temperate latitudes, but that has never been detected in tropical areas. We also found seasonal changes in the distribution of Parahaemoproteus parasites. This subgenus was detected only during the rainy seasons. We used PCR and detected Plasmodium parasites in abdomen pools from the mosquito species Mansonia titillans and Ma. pseudotitillans, pointing them as putative vectors of avian malaria. The present study shows effects of ecological succession on the structure of bird communities. Species and individuals that inhabit advanced stages are benefited by presenting lower rates of infection by pathogenic parasites. Future studies targeting periodic and long-term samplings in other seasonal tropical environments will reveal if our results are due to random variation or if they reflect seasonal changes in haemosporidian infection in tropical birds.

Estudos Experimentais de Plasmodium juxtanucleare Versiane e Gomes, 1941 em Gallus gallus utilizando as técnicas microscópicas e moleculares com ênfase na padronização de PCR em tempo real para o diagnóstico

Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio de PCR em tempo real (qPCR) para o diagnóstico de Plasmodium spp. utilizando os genes 18S rDNA e citocromo b. Foram coletadas 101 amostras de sangue de aves da espécie Gallus gallus de criação rústica ou orgânica no município de Seropédica, Rio de Janeiro. Os sangues coletados foram utilizados na preparação de esfregaços de sangue e para extração do ácido desoxirribonucléico (DNA) destas amostras. Protocolos de ensaios moleculares foram testados, tal como o PCR convencional (cPCR) e nestedPCR (nPCR) para Plasmodium spp. Neste estudo dois protocolos de qPCR foram desenvolvidos utilizando oligoiniciadores desenhados com alvo no citocromo b e 18S rDNA. O limite de detecção para os dois genes qPCR foi de 10 cópias do alvo de DNA, que foram maiores do que o limite de detecção observado em nPCR e cPCR. Em qPCR, 69,30% (n = 70/101) amostras foram positivas com alvo no gene 18SrDNA e 59,40%(n = 60/101) amostras positivas com alvo no gene citocromo b. Em nPCR e cPCR, 54,45% (n = 55/101) e 52,47% (n = 53/101) amostras foram positivas, respectivamente. Em microscopia de esfregaço de sangue, 31 (30,69%) amostras foram positivas. Não houve discordância entre os resultados (p> 0,05) de qPCR para os genes 18SrDNA e citocromo. Além disso, qPCR foi mais sensível do que as outras técnicas discutidas, principalmente relacionado com a microscopia óptica (p <0,05). Portanto, os dois ensaios de qPCR desenvolvidos neste estudo mostraram mais sensibilidade do que outras técnicas e permitiu a detecção de Plasmodium spp. em aves de criação rústica mesmo com baixa parasitemia.

This study aimed to develop a real-time PCR (qPCR) assay for diagnosis of Plasmodium spp. using as target the 18S rDNA and Cytochrome b genes. A range of 101 blood samples were collected from Gallus gallus in poultry rustic breeds of in Rio de Janeiro, Brazil. The collected bloods were used to prepare blood smears and to extract the deoxyribonucleic acid (DNA) of these samples. There with, molecular protocols were tested, such as the already published conventional PCR (cPCR) and nested PCR (nPCR), designed for Plasmodium spp. In this study two qPCR protocols were developed using primers targeting the Cytochrome b and 18S rDNA genes. The qPCR detection limit for both genes was 10 copies of the target DNA, which were higher than the detection limit observed in nPCR and cPCR. In qPCR, 69.30% (n = 70/101) samples were positive targeting 18Sr DNA gene and 59.40% (n = 60/101) samples were positive targeting Cytochrome b gene. In nPCR and cPCR, 54.45% (n = 55/101) and 52.47% (n= 53/101) samples were positive, respectively. In blood smear microscopy, 31 (30.69%) samples were positive. There was no disagreement between the results (p > 0.05) of qPCR for 18Sr DNA and Cytochrome b genes. Additionally, qPCR was more sensitive than the other techniques discussed, mostly related to blood smear microscopy (p < 0.05). Therefore, the two qPCR developed in the study showed more sensitivity than other techniques and enabled the detection of Plasmodium spp. in poultry even in low parasitemia.

Exoerythrocytic development of Plasmodium gallinaceum in primary fibroblast culture of chicken embryo / Desenvolvimento exoeritrocítico de Plasmodium gallinaceum em cultura primária de fibroblasto de embrião de galinha

In this study we assessed the susceptibility of primary fibroblast culture of chicken embryo to infection of P. gallinaceum sporozoites as well as the initial development of exoerithrocytic stages. Fibroblasts were obtained from the chest muscles of chicken embryos and sporozoites were obtained from experimentally infected Aedes fluviatilis salivary glands. After 1h, 3h, 24h, 48h and 72h periods pos-infection, cell cultures were fixed and analyzed both by indirect immunofluorescent-antibody test with anti-circumsporozoite protein monoclonal antibodies and by transmission electron microscopy. Circumsporozoite protein was detected in all parasitic forms. The mean percentage of fibroblasts with adhered or penetrated sporozoites did not significantly increase proportionately to the concentration of parasites in the inoculum, and independently if fetal calf or normal chicken sera were used in the culture medium. It was noted that the longer the incubation time, higher the possibility of the sporozoites to adhere and penetrate to fibroblats. Spozoites were observed penetrating in the fibroblast after 3h incubation when 0.68% of the cells had adhered parasites. Differentiation and development of the exoerythrocytic forms was observed after 24h incubation, when an average of 0,14% of the parasites have already invaded the cells. Developing parasites were found until 72h, when only 0.04% of fibroblasts were infected. Fibroblast cell culture seems to be a valuable experimental tool for in vitro investigation of the exoerytrocytic cycle of P. gallinaceum.(AU)

No presente estudo, avaliamos a susceptibilidade de cultura primária de fibroblastos de embrião de galinha à infecção por esporozoítas de P. gallinaceum, assim como o desenvolvimento de estágios do ciclo exoeritrocítico. Fibroblastos foram obtidos a partir da musculatura do peito de embriões de galinha e esporozoítas foram obtidos de glândulas salivares de Aedes fluviatilis experimentalmente infectados. Após períodos de 1h, 3h, 24h, 48h e 72h após a infecção, culturas de células foram fixadas e analisadas através de imunofluorescência indireta empregando-se anticorpos monoclonais contra a proteína circum-esporozoíta e microscopia eletrônica de transmissão. Proteína circum-esporozoíta foi detectada em todas as formas parasitárias. O percentual médio de fibroblastos com esporozoítas aderidos ou já penetrados não aumentou proporcionalmente com a concentração de parasitos no inóculo e independeu se o soro utilizado no cultivo celular era soro bovino fetal ou soro de galinha normal. Foi observado que, quando maior é o período de incubação, maior é a possibilidade dos esporozoítas aderirem e penetrarem nos fibroblastos. Esporozoítas foram observados penetrando em fibroblastos depois de 3h de incubação, quando 0,68% das células tinham parasitos aderidos. A diferenciação e o desenvolvimento das formas exoeritrocíticas foram observados após 24h de incubação, quando somente 0.04% dos fibroblastos achavam-se infectados. A cultura primária de fibroblastos de galinha parece ser um valioso modelo experimental para a investigação in vitro do ciclo exoeritrocítico do P. gallinaceum.(AU)

Avaliação sanitária de tucanos e araçaris (aves: piciformes) em cativeiro no estado de Minas Gerais

Tucanos e araçaris são aves da família Ramphastidae, ordem dos Piciformes. Essas aves são de grande importância ecológica, devido ao seu papel na dispersão de sementes, favorecendo a recuperação de florestas. A manutenção e reprodução de ranfastídeos em cativeiro são dificultadas por diversos fatores, incluindo erros no manejo sanitário. O presente estudo avaliou 144 ranfastídeos, sendo 129 animais do gênero Ramphastos, 11 Pteroglossus e quatro Selenidera, mantidos em 13 instituições no estado de Minas Gerais. Testes foram realizados para Plasmodium/Haemoproteus (esfregaços sanguíneos e PCR de sangue e baço), Clostridium perfringens (isolamento de swab cloacal), Chlamydophila psittaci (PCR de swab cloacal) e para a presença de endo e ectoparasitos. A presença de anticorpos contra Mycoplasma gallisepticum (MG) e Salmonella Pullorum (SP) foi avaliada por soroaglutinação rápida (SAR) e contra o Paramyxovirus aviário tipo 1 (APMV-1) através da inibição da hemaglutinação (IH). De 143 aves testadas quanto a presença de hemosporídeos, 58 foram positivas na PCR (40,5%) e apenas trofozoítos e merontes de Plasmodium spp. foram encontrados em esfregaços sanguíneos. O sequenciamento de 20 amostras revelou cinco linhagens diferentes de Plasmodium spp. que poderiam constituir quatro morfoespécies diferentes. Microfilárias foram encontradas em três de 58 tucanos avaliados (5,2%). Clostridium perfringens foi isolado de 11 aves (8,5%), sendo todos pertencentes ao tipo A e com o gene cpb2 detectado em três isolados. Ao teste da concentração inibitória mínima, todos os isolados de C. perfringens foram sensíveis à penicilina, vancomicina e metronidazol e 81 e 36% dos isolados foram sensíveis à eritromicina e oxitetraciclina, respectivamente. Todas as amostras foram resistentes à lincomicina. Endoparasitos foram encontrados em 38 (31%) aves, de 123 avaliadas, sendo que 24 (19,5%) estavam parasitadas por coccídeos e 12 (9,5%) por capilarídeos. Larvas de nematódeos foram detectadas em amostras de fezes de dois animais (1,6%). Dezesseis aves estavam parasitadas por piolhos (Phthiraptera) (11,1%) e treze por ácaros plumícolas (Astigmata) (9%), totalizando ectoparasitismo em 20,1% dos animais. As aves não apresentaram títulos detectáveis de anticorpos para MG, SP e APMV-1. Todas as aves foram negativas para C. psittaci. No total, 66,6% das aves foram positivas para pelo menos um agente etiológico, sendo que 65 (45,1%), 21 (14,6%) e 10 (7,0%) aves foram detectadas com uma, duas e três etiologias, respectivamente. Ranfastídeos, ao serem deslocados de uma instituição para outra e os candidatos à reintrodução na natureza, devem ser avaliados, para evitar a introdução de patógenos e parasitos em locais previamente isentos. Adicionalmente, aves permanentes em cativeiro possuem o risco de adquirir e transmitir patógenos de animais de vida livre, que frequentam essas instituições

Toucans and aracaris are birds of family Ramphastidae order Piciformes. Such birds are of great ecological importance for their role in seed dispersion favoring forest recomposition. Maintenance and reproduction of these birds in captivity is impaired for several reasons including improper sanitary management. The present study evaluated 144 ramphastids, being 129 from genus Ramphastos (R. toco, R. dicolorus, R. tucanus e R. vitellinus), 11 Pteroglossus (P. aracari, P. inscripitus, P. bitorquatus, P. castanoti, P. bailloni) and four Selenidera (S. maculirostris), kept in 13 different locations in Minas Gerais state. Tests were conducted for Plasmodium/Haemoproteus (microscopy of stained blood smear and PCR of blood and spleen), Clostridium perfringens (isolation from cloacal swabs), Chlamydophila psittaci (PCR of cloacal swabs) and endoparasites and ectoparasites. Antibodies against Mycoplasma gallisepticum (MG) and Salmonella Pullorum (SP) were evaluated by rapid plate agglutination test (RPA) and against avian paramyxovirus tipe 1 (APMV-1) by hemaglutination inhibition (IH). From 143 birds assessed for hemosporidians, 58 were positive (40,5%) and only trophozoites and meronts of Plasmodium spp. were visualized in blood smears. Sequencing from 20 samples yielded five different lineages of Plasmodium spp. that could constitute four different morphospecies. Microfilariae were found in three out of 58 birds evaluated. Clostridium perfringens were isolated from 11 birds (8,5%), being all type A strains, with gene cpb2 detected in three samples. In the minimum inhibitory concentration (MIC) test, all C. perfringens isolated were sensitive for penicillin, vancomycin and metronidazole, 81 and 36% of the isolates were sensitive for erithromycin and oxytetracyclin, respectively and all isolates were resistant to lincomycin. Endoparasites were found in 38 (31%) birds, with 24 parasitized by coccidians (19,5%) and 12 (9,5%) by capillarids. Sixteen birds were parasitized by lices (Phthiraptera) (11,1%) and 13 by feather mites (Astigmata) (9%). Birds did not show antibodies titres for MG, SP and APMV-1 and were negative for C. psittaci. In this study, 66,6% of the birds were shown with at least one etiology assessed, being 66 (45,1%), 21 (14,6%) and 10 (7,0%), with one, two and three etiologycal agents, respectively. Preventive veterinary medicine against infectious and parasitic diseases of ranfastids should involve testing and quarantine of birds to be transported to another holding or released into the wild. Ramphastids should be assessed for parasitic and infectious diseases prior to being transferred between captive facilities and before reintroductions in nature, in order to prevent the introduction of pathogens and parasites in places previously absent

Estudo da infecção por plasmodium spp.em araras mantidas em cativeiro no DF

As araras possuem grande importância epidemiológica relacionada às doenças aviárias, pois estão entre as espécies que mais transitam no comércio legal e ilegal de animais silvestres e têm sido incluídas em programas de permuta entre instituições e de reintrodução da fauna a natureza. Essas aves podem ser acometidas pela malária aviária causada por protozoários do gênero Plasmodium, transmitidos por mosquitos hematófagos da família Culicidae. A infecção pode ter curso subclínico e até casos com morte súbita e alterações laboratoriais como anemia hemolítica e leucocitose. Este estudo teve como objetivos determinar a ocorrência da infecção por Plasmodium spp. em araras oriundas de criadouros do Distrito Federal e Goiás por meio de reação de polimerase em cadeia (PCR) e microscopia óptica bem como comparar o perfil hematológico e bioquímico dos animais infectados com aquele dos animais não infectados. Foram analisadas 96 amostras de sangue das espécies Ara ararauna, A. chloroptera, A. macao e Anodorhynchus hyacinthinus para realização de hemograma, bioquímicos séricos e pesquisa da infecção por Plasmodium por meio de nested PCR e microscopia óptica. Os resultados demonstraram a ocorrência da infecção em 7,29% (7/96) e 4,16% (4/96) das amostras por meio de PCR e microscopia óptica, respectivamente. A infecção não causou alterações significativas no hemograma e perfil bioquímico, com exceção da albumina, que é uma proteína de fase aguda negativa, e sua concentração pode ter reduzido devido ao processo infeccioso. Esses resultados denotam que a ocorrência de infecção por Plasmodium spp. nas regiões é baixa e sugerem que as cepas dos protozoários que parasitam essas araras são pouco patogênicas. Contudo, existe a necessidade de mais estudos a cerca dos plasmódios no que diz respeito à distribuição, transmissão, patogenia, manifestação clínica e patologia clínica para melhor compreender o ciclo biológico desses protozoários nas araras

Estudo clínico e laboratorial da infecção por Plasmodium spp. e parasitos gastrointestinais em pingüins -de- magalhães (Spheniscus magellanicus Foster 1758) resgatados por três Instituições no litoral sudeste do Brasil

Os pinguins-de-Magalhães(Spheniscus magellanicusFoster 1781)são aves marinhas migratórias que buscam alimento na plataforma continental brasileira. Nesse trajeto, alguns indivíduos se perdem e podem encalhar em áreas costeiras nacionais, como o Rio de Janeiro. Nessas ocasiões, estão debilitados e frequentemente adquirem doenças, com destaque para a malária aviária e as parasitoses gastrointestinais. Assim, objetivou-se avaliar a frequência de Plasmodiumspp. e dos endoparasitos em S. magellanicusde três instituições do sudeste do Brasil, observando os resultados do hemograma e bioquímicas séricas, além dos sinais clínicos encontrados. Amostras de sangue e fezes foram obtidas para realização de sexagem, hemograma, bioquímica sérica, pesquisa de Plasmodiumspp. ao esfregaço sanguíneo e pela Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) e exame parasitológico de fezes. Foram avaliados75 animais, dos quais34,67%obtiveram resultado positivo para Plasmodiumspp.pela microscopia óptica e/ou pela PCR.Observou-se que 62,67% dos pinguins avaliados eram fêmeas e 28% eram machos. Houve diferença significativa a 5% de probabilidade, com teste Qui-quadrado,para as médias de peso, leucometria global, linfócitos, ácido úrico e albumina entre os animais negativos e positivos para Plasmodiumspp. A frequência de mucosa hipocorada, anorexia, alterações neurológicas e diarreia foi significativamente maior nos pinguins com a malária. Foram obtidas 47amostras fecais para exames parasitológicos, das quais 31,91% (15/47) estavam parasitadas, sendo encontrados os gêneros Contracaecume Cardiocephaloides, além de oocistos de coccídios intestinais. Houve diferença significativa a 5% de probabilidade na frequência de parasitos gastrointestinais encontrados nos pinguins infectados por Plasmodiumspp. A partir da análise dos resultados foi possível concluir que a malária aviária ocorre em pinguins-de-Magalhães do sudeste do Brasil, sendo uma doença predominantemente crônica com alterações clínico-laboratoriais que sugerem lesão renal, hepática e/ou desnutrição. Também foi relevante a frequência do parasitismo gastrointestinal. Pode haver relação entre a frequência de parasitos gastrointestinais e a infecção por Plasmodiumspp. decorrente de queda na imunidade. Em última análise,as mensurações bioquímicas apoiadas aos valores de hemograma e exame físico minucioso fornecem dados importantes no diagnóstico e prognóstico da malária aviária em pinguins-de-Magalhães