Evaluation of mesenchymal cells and dapsone for the treatment of dermonecrotic wounds caused by Loxosceles laeta venom in rabbits / Avaliação de células mesenquimais e dapsona para o tratamento de feridas dermonecróticas causadas pelo veneno de Loxosceles laeta em coelhos

This study aimed to evaluate the efficacy of mesenchymal stem cells (MSC), alone or associated with dapsone (DAP), in treating dermonecrotic wounds caused by Loxosceles laeta venom. Twenty-five male rabbits were distributed into five groups. Negative control received ultrapure water (C-), whilst all other groups were injected with 20 μg of L. laeta venom. After 4 hours, each group received one of the following treatments: PBS (C+), DAP, MSC, and DAP+MSC. Animals were evaluated daily and photographic records made for analysis of wound area. Twelve days after, animals were euthanized and skin samples removed for histological analysis. We observed that DAP showed the best percentage of wound contraction at day 3. In the treatments using MSCs, a negative value of wound contraction was observed for the isolated MSCs, as well as a lower contraction value for the association of the MSC + DAP when compared to PBS, probably, by the increase in initial infammation after the application of stem cells, due to the fact that MSCs secrete a broad spectrum of bioactive molecules such as cytokines and growth factors that favor regeneration. Histologically, it was observed that animals of C+ showed extensive areas of necrosis, ulcers, neutrophilic infiltrate, and mineralization. Collagen deposition showed increase in MSC+DAP treatment, however vascularization remained unchanged. This is the first report using MSC and MSC+DAP as a treatment for cutaneous loxoscelism and more studies are needed to determine its use as an alternative therapy for dermonecrotic lesions caused by Loxosceles spider.

Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia das células-tronco mesenquimais (CTMs), isoladas ou associadas à dapsona (DAP), no tratamento de feridas dermonecróticas causadas pelo veneno de Loxosceles laeta. Vinte e cinco coelhos machos foram distribuídos em cinco grupos. O controle negativo recebeu água ultrapura (C-), enquanto todos os outros grupos foram injetados com 20 μg de veneno de L. laeta. Após 4 horas, cada grupo recebeu um dos seguintes tratamentos: PBS (C+), DAP, CTMs e DAP + CTMs. Os animais foram avaliados diariamente durante 12 dias, e feitos registros fotográficos para análise da ferida e no 12º dia, foram eutanasiados e, retiradas amostras de pele para análise histológica. Observou-se que a DAP apresentou o melhor percentual de contração da ferida no terceiro dia. Nos tratamentos com CTMs, observou-se uma contração negativa da ferida tanto para as CTMs isoladas, bem como a associação CTMs + DAP em relação ao PBS, possivelmente, pelo aumento da infamação inicial após a aplicação de células-tronco. Isso é devido ao fato de que as CTMs secretam um amplo espectro de moléculas bioativas como citocinas e fatores de crescimento que favorecem a regeneração. Histologicamente, observou-se que os animais de C+ apresentaram extensas áreas de necrose, úlceras, infiltrado neutrofílico, além de mineralização. Houve aumento de deposição de colágeno no tratamento CTMs + DAP, no entanto, a vascularização permaneceu inalterada. Este é o primeiro relato usando CTMs e CTMs + DAP como tratamento para loxoscelismo cutâneo e mais estudos são necessários para determinar seu uso como terapia alternativa para lesões demonecróticas causadas pela aranha Loxosceles.

Percutaneous application of allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell in dogs submitted to minimally invasive plate osteosynthesis of the tibia

Purpose To evaluate clinical outcome following minimally invasive plate osteosynthesis (MIPO) associated with percutaneous transplantation of allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) at the tibial fracture site in dogs. Methods Thirty-six dogs presenting with nonarticular complete tibial fracture were included in this study. All fractures were treated by the same MIPO technique. The animals were divided in group 1 (n = 20) received a percutaneous application of 3 × 106 AD-MSC at the fracture site and group 2 (n = 16) did not receive any adjuvant treatment. Postoperative radiographic examinations were made at 15, 30, 60, 90 and 120 days. Results Fifty-eight percent of the patients were classified as skeletally immature. The median weight of the animals was 18.8 kg. The mean radiographic union time differed statistically between the AD-MSC group (28.5 days) and the control group (70.3 days). Sixty percent of dogs in group 1 and 56.25% of the group 2 were considered immature. Conclusions The use of allogeneic AD-MSC cell therapy and MIPO is a safe, viable and effective technique for promoting bone healing in nonarticular tibial fractures in dogs.(AU)

Effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells on the epithelialization of rabbits' skin autograft (Oryctolagus cuniculus) / Efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães na epitelização de autoenxertos de pele em coelhos (Oryctolagus cuniculus)

The present study aimed to evaluate the effects of mesenchymal stem cells derived from canine adipose tissue in the healing process of full-thickness mesh skin grafts in rabbits. The stem cells were collected from young dogs; and, after characterization, remained in cryopreservation, in independent doses containing 2 x 106 cells. The mesh distal limb graft technique was performed in 60 rabbits, divided into three groups, CG (Control Group), GT1 (Intralesional Stem Cell Treated Group), and GT2 (Intravenous Stem Cell Treated Group), containing 20 animals each. After grafting, each group was randomly divided into four subgroups according to euthanasia time 3, 7, 14, and 30 days, containing five animals in each group. Animals of GT1_14, GT1_30, and GT2_14, GT2_30 subgroups received a second dose of xenogeneic cells on the seventh day. Meanwhile, animals from GT1_30 and GT2_30 received the third dose of xenogeneic cells on day 14. The groups treated with xenogeneic stem cells positively affected type III collagen re-epithelialization and deposition, and possibly GT1 had a controlled inflammatory response. However, no effect on angiogenesis. Thus, it was possible to demonstrate tolerance and therapeutic action of mesenchymal stem cells from canine adipose tissue in skin grafts in rabbits.(AU)

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães no processo de cicatrização de autoenxertos de pele de espessura total em malha em coelhos. As células-tronco foram coletadas de cães jovens, após a caracterização estas permaneceram em criopreservação, em doses individuais contendo 2 x 106 células. A técnica de enxerto em malha na região distal do membro foi realizada em 60 coelhos, divididos em três grupos, GC (Grupo Controle), GT1 (Grupo tratado com células-tronco intralesional) e GT2 (Grupo tratado com células-tronco via endovenosa), contendo 20 animais cada. Imediatamente após a enxertia, cada grupo foi dividido aleatoriamente em quatro subgrupos, de acordo com o tempo de eutanásia 3, 7, 14 e 30 dias contendo cinco animais cada. Animais dos subgrupos GT1_14, GT1_30 e GT2_14, GT2_30 receberam uma segunda dose de células xenógenas no sétimo dia. Ademais, animais do GT1_30 e do GT2_30 receberam a terceira dose de células xenógenas no dia 14. Os grupos tratados com células-tronco xenógenas tiveram um efeito positivo na reepitelização e deposição de colágeno tipo III, e possivelmente, o GT1 teve uma resposta inflamatória controlada, entretanto o efeito na angiogênese não foi observado. Dessa forma, foi possível demonstrar que houve tolerância e ação terapêutica das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães em enxertos de pele em coelhos.(AU)

Effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells on the epithelialization of rabbits' skin autograft (Oryctolagus cuniculus) / Efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães na epitelização de autoenxertos de pele em coelhos (Oryctolagus cuniculus)

The present study aimed to evaluate the effects of mesenchymal stem cells derived from canine adipose tissue in the healing process of full-thickness mesh skin grafts in rabbits. The stem cells were collected from young dogs; and, after characterization, remained in cryopreservation, in independent doses containing 2 x 106 cells. The mesh distal limb graft technique was performed in 60 rabbits, divided into three groups, CG (Control Group), GT1 (Intralesional Stem Cell Treated Group), and GT2 (Intravenous Stem Cell Treated Group), containing 20 animals each. After grafting, each group was randomly divided into four subgroups according to euthanasia time 3, 7, 14, and 30 days, containing five animals in each group. Animals of GT1_14, GT1_30, and GT2_14, GT2_30 subgroups received a second dose of xenogeneic cells on the seventh day. Meanwhile, animals from GT1_30 and GT2_30 received the third dose of xenogeneic cells on day 14. The groups treated with xenogeneic stem cells positively affected type III collagen re-epithelialization and deposition, and possibly GT1 had a controlled inflammatory response. However, no effect on angiogenesis. Thus, it was possible to demonstrate tolerance and therapeutic action of mesenchymal stem cells from canine adipose tissue in skin grafts in rabbits.(AU)

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães no processo de cicatrização de autoenxertos de pele de espessura total em malha em coelhos. As células-tronco foram coletadas de cães jovens, após a caracterização estas permaneceram em criopreservação, em doses individuais contendo 2 x 106 células. A técnica de enxerto em malha na região distal do membro foi realizada em 60 coelhos, divididos em três grupos, GC (Grupo Controle), GT1 (Grupo tratado com células-tronco intralesional) e GT2 (Grupo tratado com células-tronco via endovenosa), contendo 20 animais cada. Imediatamente após a enxertia, cada grupo foi dividido aleatoriamente em quatro subgrupos, de acordo com o tempo de eutanásia 3, 7, 14 e 30 dias contendo cinco animais cada. Animais dos subgrupos GT1_14, GT1_30 e GT2_14, GT2_30 receberam uma segunda dose de células xenógenas no sétimo dia. Ademais, animais do GT1_30 e do GT2_30 receberam a terceira dose de células xenógenas no dia 14. Os grupos tratados com células-tronco xenógenas tiveram um efeito positivo na reepitelização e deposição de colágeno tipo III, e possivelmente, o GT1 teve uma resposta inflamatória controlada, entretanto o efeito na angiogênese não foi observado. Dessa forma, foi possível demonstrar que houve tolerância e ação terapêutica das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cães em enxertos de pele em coelhos.(AU)

Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells from goat umbilical cord blood

ABSTRACT: Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these cells. However, the MSC isolation from the goat UCB has not been demonstrated. Therefore, the aim of the present study was to isolate, culture and characterize goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10% or 20% FBS. FACS analysis was performed and induction lineage differentiation was made to characterize these cells. They exhibited two different populations in flow cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but negative staining for CD34 in larger cells, and positive stained for CD90 and CD105, but negative for CD44 and CD34 in the smaller cells. MSC from goat UCB showed capability to differentiate into chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Present study established that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood.

RESUMO: As células tronco mesenquimais (MSC) residem em pequenas quantidades em muitos tecidos e órgãos adultos, desempenhando um papel ativo na homeostase destes locais. O isolamento de MSC já foi demonstrado em amostras de medula óssea, tecido adiposo e fluido amniótico de cabras. O sangue de cordão umbilical é considerado uma fonte importante desse tipo de células. No entanto, até o presente momento, não foi demonstrado o isolamento de MSC provenientes do sangue de cordão umbilical de cabras. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi isolar, cultivar e caracterizar células tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino. As MSC foram isoladas utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Paque e cultivadas em DMEM suplementado com 10% ou 20% de FBS. A caracterização desse tipo celular foi realizada através de análise por citometria de fluxo e diferenciação em linhagens celulares mesodermais. A analise no citômetro de fluxo demonstrou a presença de duas populações distintas, um grupo com células maiores e outro com células menores; observando expressão positiva de CD90, CD44 e CD105, e negativa para CD34 nas células maiores; enquanto que as menores foram positivas para CD90 e CD105, mas negativas para CD44 e CD34. As células isoladas demonstraram capacidade de se diferenciar em condrócitos e osteoblastos quando incubadas com meio de diferenciação específico. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais podem ser obtidas com sucesso do sangue do cordão umbilical caprino.

Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells from goat umbilical cord blood / Isolamento, cultura e caracterização de células tronco mesenquimais multipotentes provenientes do sangue do cordão umbilical caprino

Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these cells. However, the MSC isolation from the goat UCB has not been demonstrated. Therefore, the aim of the present study was to isolate, culture and characterize goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10% or 20% FBS. FACS analysis was performed and induction lineage differentiation was made to characterize these cells. They exhibited two different populations in flow cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but negative staining for CD34 in larger cells, and positive stained for CD90 and CD105, but negative for CD44 and CD34 in the smaller cells. MSC from goat UCB showed capability to differentiate into chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Present study established that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood.(AU)

As células tronco mesenquimais (MSC) residem em pequenas quantidades em muitos tecidos e órgãos adultos, desempenhando um papel ativo na homeostase destes locais. O isolamento de MSC já foi demonstrado em amostras de medula óssea, tecido adiposo e fluido amniótico de cabras. O sangue de cordão umbilical é considerado uma fonte importante desse tipo de células. No entanto, até o presente momento, não foi demonstrado o isolamento de MSC provenientes do sangue de cordão umbilical de cabras. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi isolar, cultivar e caracterizar células tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino. As MSC foram isoladas utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Paque e cultivadas em DMEM suplementado com 10% ou 20% de FBS. A caracterização desse tipo celular foi realizada através de análise por citometria de fluxo e diferenciação em linhagens celulares mesodermais. A analise no citômetro de fluxo demonstrou a presença de duas populações distintas, um grupo com células maiores e outro com células menores; observando expressão positiva de CD90, CD44 e CD105, e negativa para CD34 nas células maiores; enquanto que as menores foram positivas para CD90 e CD105, mas negativas para CD44 e CD34. As células isoladas demonstraram capacidade de se diferenciar em condrócitos e osteoblastos quando incubadas com meio de diferenciação específico. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais podem ser obtidas com sucesso do sangue do cordão umbilical caprino.(AU)

Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells from goat umbilical cord blood / Isolamento, cultura e caracterização de células tronco mesenquimais multipotentes provenientes do sangue do cordão umbilical caprino

Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these cells. However, the MSC isolation from the goat UCB has not been demonstrated. Therefore, the aim of the present study was to isolate, culture and characterize goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10% or 20% FBS. FACS analysis was performed and induction lineage differentiation was made to characterize these cells. They exhibited two different populations in flow cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but negative staining for CD34 in larger cells, and positive stained for CD90 and CD105, but negative for CD44 and CD34 in the smaller cells. MSC from goat UCB showed capability to differentiate into chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Present study established that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood.(AU)

As células tronco mesenquimais (MSC) residem em pequenas quantidades em muitos tecidos e órgãos adultos, desempenhando um papel ativo na homeostase destes locais. O isolamento de MSC já foi demonstrado em amostras de medula óssea, tecido adiposo e fluido amniótico de cabras. O sangue de cordão umbilical é considerado uma fonte importante desse tipo de células. No entanto, até o presente momento, não foi demonstrado o isolamento de MSC provenientes do sangue de cordão umbilical de cabras. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi isolar, cultivar e caracterizar células tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino. As MSC foram isoladas utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Paque e cultivadas em DMEM suplementado com 10% ou 20% de FBS. A caracterização desse tipo celular foi realizada através de análise por citometria de fluxo e diferenciação em linhagens celulares mesodermais. A analise no citômetro de fluxo demonstrou a presença de duas populações distintas, um grupo com células maiores e outro com células menores; observando expressão positiva de CD90, CD44 e CD105, e negativa para CD34 nas células maiores; enquanto que as menores foram positivas para CD90 e CD105, mas negativas para CD44 e CD34. As células isoladas demonstraram capacidade de se diferenciar em condrócitos e osteoblastos quando incubadas com meio de diferenciação específico. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais podem ser obtidas com sucesso do sangue do cordão umbilical caprino.(AU)

UTILIZAÇÃO DE CÉLULA-TRONCO MESENQUIMAL ASSOCIADA AO EXERCÍCIO COMO ABORDAGEM TERAPÊUTICA PARA OTIMIZAR A REGENERAÇÃO DE NERVO ISQUIÁTICO EM CAMUNDONGOS

Lesões nervosas periféricas (PNI) podem causar dor neuropática, perda de massa muscular e um longo tempo para reabilitação. A capacidade regenerativa e a recuperação funcional da dependem do grau da lesão, da idade e da distância entre o dano do nervo e o músculo-alvo. Principalmente, essa regeneração é pobre e limitada. O exercício é usado em ensaios clínicos para reduzir a atrofia muscular e estimular a plasticidade. A terapia com células-tronco mesenquimais (MSC) promove a produção de neurotrofinas, substratos e um microambiente ideal para o reparo de tecidos. Nós analisamos os efeitos regenerativos da terapia com MSC e exercícios de natação (SW) no modelo de compressão do nervo isquiático de camundongo. As MSC foram injetadas (300ul, 1x106, ip.) 7 dias após a lesão e o SW foi iniciado 14 dias após a lesão, realizado 3 vezes por semana durante 20 minutos. Foram estudados 4 grupos: DMEM (inoculação de meio de cultura), DMEM + SW (meio de cultura e exercício), MSC (apenas inoculação de células-tronco mesenquimais), MSC + SW (associação de exercício e terapia celular). A análise funcional (LSS e SFI) foi feita antes da cirurgia, um dia após e semanalmente durante 8 semanas, quando os animais foram sacrificados para avaliação morfológica (microscopia de luz e eletrônica). Nossos resultados mostraram que a terapia combinada com MSC e SW apresentou um maior número de fibras mielinizadas e não mielinizadas e um grande número de fibras dentro da razão G ideal. Os resultados mostraram maior sobrevida dos neurônios motores e sensoriais e melhor recuperação das funções motoras. Concluímos que o uso de células-tronco mesenquimais e a natação aceleram a regeneração axonal promovendo a recuperação precoce das funções motoras e sensoriais.

Peripheral nervous (PN) injuries can cause neuropathic pain, loss of muscle mass, and a long time to rehabilitation. The PN regenerative capacity and functional recovery are dependent on the degree of PN injuries, age, and the distance from the nerve damage to the target muscle. Mostly, this regeneration is poor and limited. Exercise is used in clinical trials to reduce muscle atrophy and stimulate plasticity. The mesenchymal stem cells (MSC) therapy combines regenerative and tissue replacement to promote neurotrophins production and substrates for regeneration. We analyzed the regenerative effects of MSC therapy and swimming exercise (SE) in the mouse sciatic nerve compression model. MSC was injected (300ul, 1x106,ip.) 7 days after injury. SE was started 14 days after injury, performed 3 times a week for 20 minutes. We studied 4 groups: DMEM (cell culture medium injected), DMEM+SW (DMEM and SE), MSC (mesenchymal stem cells injected), MSC+SW (combined SE and cell therapy). Functional analysis (LSS and SFI) was made before surgery, one day after, and weekly for 8 weeks when animals were euthanized for morphological assessment (light microscopy and electronica). Our results showed that combined MSC therapy and SE presented a higher number of myelinated and unmyelinated fibers and a large number of fibers within the ideal G-ratio. The results showed motor and sensory neurons survival and better recovery of motor and sensory functions. We conclude that the use of mesenchymal stem cells and swimming accelerates axonal regeneration promoting early recovery of motor and sensory functions.

Utilização de exossomos para melhoria da viabilidade de células tronco derivadas da membrana amniótica canina

SCASSIOTTI, Rodrigo Ferreira. Utilização de exossomos para melhoria da viabilidade de células tronco derivadas da membrana amniótica canina. 52 f. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciências) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. Estudar o processo de comunicação e diferenciação celular é fundamental para o melhor entendimento do organismo como um todo. Para tanto, se faz necessário entender a interação entre células que ocorre por meio da comunicação e transporte de proteínas, lipídeos e materiais genéticos, realizada através da secreção de vesículas extracelulares, como os exossomos. Assim, este trabalho tem por principal objetivo avaliar o efeito da suplementação basal de exossomos em culturas celulares com células-tronco mesenquimais (CTM) amnióticas canina. Foi realizado o isolamento de células derivadas do tecido amniótico de cães, cultura e cultivo das mesmas com meio DMEM suplementado por soro fetal bovino, antibiótico, antifúngico e aminoácidos essenciais, até que atingissem de 80 a 90% de confluência, quando então era realizada nova passagem celular. Também foi realizada a determinação de curva de crescimento. Posteriormente, as células foram caracterizadas e diferenciadas em linhagem adipogênica, condrogênica e osteogênica. Realizou-se o isolamento de vesículas extracelulares através de protocolo de ultracentrifugação e caracterização das mesmas por Nanosight. Exossomos foram suplementados a culturas basais de CTM, padronizadas em placas de 12 poços com concentração de 3x104 células por poço, em triplicata técnica e biológica, para avaliação de alterações em padrões de curva de crescimento, determinando-se assim sua capacidade de melhoria em viabilidade celular em passagens naturalmente ineficientes. Os resultados demonstraram um aumento de 15 a 20% na taxa de expansão dos cultivos suplementados com vesículas extraídas em passagens P1 e P2, quando comparadas ao grupo controle, bem como uma maior resistência ao processo de apoptose celular. Tal resultado foi corroborado por análise estatística através de Teste de Dunnett, com p0.5, comprovando a correlação positiva entre a suplementação e taxa de expansão, indicando, desta forma, não só a importância dos exossomos no processo de comunicação celular, mas também a viabilidade de um protocolo de suplementação de cultivos para fins terapêuticos.

SCASSIOTTI, Rodrigo Ferreira. Use of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes to improve the viability of canine amniotic stem cells 52 f. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciências) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. Studying the cellular intercommunication and differentiation process is crucial for a better understanding of the organism as a whole. Therefore, it is necessary to understand the interaction between cells that occurs through the communication and transport of proteins, lipids and genetic materials, carried out through the secretion of extracellular vesicles, such as exosomes. This study aims to evaluate the effect of basal supplementation of exosomes in cell cultures with canine amniotic mesenchymal stem cells (MSC). Mesenchymal Stem Cells derived from amniotic tissue of dogs were isolated and cultivated in cultures suplemented with DMEM medium, fetal bovine serum, antibiotics, antifungal and essential amino acids, until performing cellular passage at 80-90% confluence. The growth curve was determined, presenting peak cell growth in second passage followed by decline until the fifth passage. The cells were then characterized and differentiated into adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages. Extracellular vesicles were isolated using an ultracentrifugation protocol and characterized by Nanosight. Exosomes were supplemented to MSC cultures medium, standardized in 12-well plates with a concentration of 3x104 cells per well, in technical and biological triplicate, to evaluate changes in growth curve patterns, thus determining their ability to improve cellular viability in naturally inefficient passages. The results showed a 15 to 20% increase in the expansion rate of cultures supplemented with vesicles extracted in P1 and P2 passages, when compared to the control group, as well as a greater resistance to the cellular apoptosis process. This result was corroborated by statistical analysis using the Dunnett Test, with p0.5, proving the positive correlation between supplementation and expansion rate, thus indicating not only the importance of exosomes in the cell communication process, but also the feasibility of a culture supplementation protocol for therapeutic purposes.

Imuno-expressão de Bcl-xl, Bax e Caspase-3 em 5 células tronco mesenquimais da medula óssea e do tecido adiposo de ratas 6 submetidas à diferenciacao condrogenica com e sem triiodotironina: estudo 7 comparativo

Objetivou-se avaliar e comparar a expressão de Bcl-xL, Bax e caspase-3 em células 12 tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) e do tecido adiposo (CTM-TA) de13 ratas submetidas à diferenciação condrogênica in vitro na ausência ou presença de 14 triiodotironina (T3). CTM foram submetidas à diferenciação condrogênica por 21 dias 15 sem T3 (grupo controle) e com diferentes concentrações de T3 (0,01; 1; 100 e 1000 16 nM). Ao final da diferenciação, foi realizada imunohistoquímica para marcação das 17 proteínas Bcl-xL, Bax e caspase-3. O software de análise de imagem digital IHC 18 profile foi utilizado para avaliação das imunomarcações. Realizou-se análise de 19 variância e os testes de Shapiro Wilk, Tukey e Teste t. T3 reduziu significativamente 20 a expressão de Bcl-xL nas concentrações de 0,01; 1 e 100 nM, nas CTM-MO, mas 21 aumentou sua expressão nas CTM-TA na concentração de 0,01 nM. T3 aumentou a22 expressão de Bax nas concentrações de 0,01 e 100 nM, nas CTM-MO e na 23 concentração de 1000 nM, nas CTM-TA. A T3 não alterou significativamente a 24 expressão de caspase 3 nas CTM-MO, mas a reduziu significativamente nas 25 concentrações de 1 e 1000 nM, nas CTM-TA. Comparando-se as duas fontes de 26 CTM, a expressão de Bax e de caspase-3 foi significativamente maior nas CTM-MO 27 tratadas com T3, quando comparadas às CTM-TA. Conclui-se que a T3 influencia de 28 forma distinta a imuno-expressão de marcadores anti- e pró-apoptóticos em CTM29 MO e CTM-TA submetidas à diferenciação condrogênica. A T3 reduz a expressão 30 de Bcl-xL, aumenta a expressão de Bax e não altera a expressão de caspase-3 nas 31 CTM-MO e aumenta a expressão de Bcl-xL e de Bax e reduz a expressão de 32 caspase 3 nas CTM-TA. Essa diferença de resposta pode ser um dos mecanismos 33 para explicar os efeitos diferentes da T3 durante a diferenciação condrogênica das 34 CTM da medula óssea e do tecido adiposo.

The aim of this study was to evaluate and compare the expression of Bcl-xL, Bax and 12 caspase-3 in mesenchymal stem cells from bone marrow (BMMSCs) and adipose 13 tissue (ADSCs) of female rats submitted to in vitro chondrogenic differentiation in the 14 absence or presence of triiodothyronine (T3). MSC were subjected to chondrogenic 15 differentiation for 21 days without T3 (control group) and with different concentrations 16 of T3 (0.01; 1; 100 and 1000 nM). At the end of differentiation, immunohistochemistry 17 was performed to label the Bcl-xL, Bax and caspase-3 proteins. The IHC profile 18 digital image analysis software was used to assess immunostaining. Analysis of 19 variance and Shapiro Wilk, Tukey and t-test were performed. T3 significantly reduced 20 Bcl-xL expression at concentrations of 0.01; 1 and 100 nM, in BMMSCs, but 21 increased its expression in ADSCs at a concentration of 0.01 nM. T3 increased Bax 22 expression at concentrations of 0.01 and 100 nM in BMMSCs and at a concentration 23 of 1000 nM in ADSCs. T3 did not significantly alter caspase 3 expression in 24 BMMSCs, but significantly reduced it at concentrations of 1 and 1000 nM in ADSCs. 25 Comparing the two MSC sources, the expression of Bax and caspase-3 was 26 significantly higher in BMMSCs treated with T3 when compared to ADSCs. It is 27 concluded that T3 distinctly influences the immunoexpression of anti- and pro28 apoptotic markers in BMMSCs and ADSCs submitted to chondrogenic differentiation. 29 T3 reduces the expression of Bcl-xL, increases the expression of Bax and does not 30 alter the expression of caspase-3 in the BMMSCs and increases the expression of 31 Bcl-xL and Bax and reduces the expression of caspase 3 in the ADSCs. This 32 difference in response may be one of the mechanisms to explain the different effects 33 of T3 during the chondrogenic differentiation of MSCs from bone marrow and 34 adipose tissue.

Anticoagulants on yield of bone marrow-derived mononuclear cells harvested from dogs / Anticoagulantes no rendimento de células mononucleares da medula óssea de cães

Cell therapy with bone marrow-derived mononuclear cells is an alternative to therapy with mesenchymal stem cell cultures. The aim of the present research was the comparison of the yield of bone marrow-derived mononuclear cells harvested from dogs with two different anticoagulants. Bone marrow was harvested from the iliac crest of five healthy dogs aged between 15 and 30 months, and the effect of two anticoagulant solutions, CPDA-1 (citrate phosphate dextrose adenine-1) and heparin, on the isolation of mononuclear cells was compared. Mononuclear cells were isolated in a density gradient and stained for CD9 and CD44 for characterization by flow cytometry. Means were compared using Student's paired t-test. Samples harvested with CPDA-1 yielded an average of 5.16x106 (±1.76x106) to 20.20x106 (±1.55x106) mononuclear cells/mL, whereas the yield of samples harvested with heparin varied between 4.56x106 (±0.69x106) and 24.30x106 (±2.12x106) mononuclear cells mL-1. By flow cytometry, mean percentage of double-stained cells varied from 1.96% (±0.64%) to 5.01% (±0.73%) for CPDA-1 and from 2.23% (±0.70%) to 7.27% (±0.97%) for heparin. No significant statistical differences were observed on yield or CD9 and CD44 expression. Further studies are recommended to assess efficacy of CPDA on mononuclear cell isolation.(AU)

A terapia com células mononucleares de medula óssea é uma alternativa ao cultivo de células-tronco mesenquimais. O objetivo deste trabalho foi comparar o rendimento de células mononucleares derivadas da medula óssea de cães, colhidas com dois anticoagulantes diferentes. Foram coletadas medulas ósseas de cinco cães hígidos, com idades variando entre 15 e 30 meses, por punção na crista ilíaca. Foi comparado o efeito da solução anticoagulante no isolamento das células mononucleares, utilizando-se CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrose, adenina) ou heparina como soluções anticoagulantes. As células mononucleares foram isoladas em gradiente de densidade e caracterizadas fenotipicamente em citometria de fluxo. Os resultados foram submetidos ao Teste t pareado para comparação de médias. Nas amostras coletadas com CPDA-1, o rendimento médio variou entre 5,16 x 106 (±1,76x106) a 20,20x106 (±1,55x106) células mononucleares mL-1, enquanto que, nas amostras coletadas com heparina, o rendimento variou entre 4,56x106 (±0,69x106) a 24,30x106 (±2,12x106) células mononucleares/mL. Na citometria de fluxo, a média de células duplo-marcadas variou de 1,96% (±0,64%) a 5,01% (±0,73%) para CPDA-1 e de 2,23% (±0,70%) a 7,27% (±0,97%) para heparina. Não foram observadas diferenças estatísticas no rendimento ou na expressão de CD9 e CD44. Recomendam-se estudos adicionais para avaliar melhor a eficácia do CPDA no isolamento de células mononucleares.(AU)

Penile reconstruction using mesenchymal stem cells

To compare the reconstruction of corpus cavernosum segments when seeded with mesenchymal stem cells and when stem cells are infused intravenously.METHODS: Sixteen New Zealand rabbits were submitted to reconstruction of the corpus cavernosum and distributed in Group A - decellularized matrices, Group B - decellularized matrices seeded with mesenchymal stem cells Group C - decellularized matrices submitted to intravenous infusion of mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cells were obtained by bone marrow aspiration. The venous filling aspect of the distal end of the corpus cavernosum was evaluated and the specimens were submitted to histological analisis and to immunohistochemistry. Cavernosometry was done in one animal of each groupRESULTS: Three animals on B and three animals on C presented full filling of distal end of the corpus cavernosum. No animals in A presented filling of the distal end of corpus cavernosum. At cavernosometry the animal on B attained 50 cmH2O, on C 110 cmH2O and on A 20 cmH2O. Trabeculae forming cavernous sinuses were found in groups B and C.CONCLUSION: The reconstruction of corpus cavernosum using descellularized matrices and mesenchymal stem cells, either by intravenous injection or directly seeded is possible, with growth of corpus cavernosum-like tissue.(AU)

Effectiveness of microwell-based in vitro culture systems for zona-free cloned bovine embryos

Background: Modified embryo in vitro culture (IVC) systems have been devised for the culture of individual embryos, suchas in microdroplets, capillary tubes, or co-cultures systems. However, the development of the Well-of-the-Well (WOW)system takes advantage of both the individual and the grouped culture systems, as embryos are cultured into microwellsdisposed into a larger well. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo developmental potential of handmade cloning (HMC)-derived cloned bovine embryos after the IVC in three microwell (WOW) systems.Material, Methods & Results: Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) isolated after subcutaneous biopsy from a Nellore adult female were used as nucleus donor cells for cloning. Collected adipose tissue was incubated in0.075% collagenase for 60 min at 39oC. After digestion, cell suspension was centrifuged at 80 g for 10 min, supernatantwas discarded, and 2 mL of Red Blood Cells Lysis Buffer (RBC) was added to the pellet, remaining for 2 min. The RBCbuffer was diluted with 20 mL PBS, with cell suspension spun at 80 g for 5 min. Supernatant was discarded and the pelletre-suspended in DMEM culture medium + 10% fetal calf serum (FCS). Following cell counting, 5 x 105 cells were seededin 25-cm² bottles containing 6 mL DMEM + 10% FCS, and cultured at 38.3°C, 5% CO2 in air and saturated humidity.After IVM, oocytes were denuded and incubated in demecolcine, followed by zona pellucida removal, oocyte bisection,embryo reconstruction, electrofusion and chemical activation. Cloned embryos were allocated to one of three IVC groups:cWOW: conventional microwells (250 µm, round); mWOW: modified microwells (130 µm, conical); and WOW-PDMS:microwells in polydimethylsiloxane chips (170 µm, cylindrical, with interconnecting microchannels); IVF embryos wereused as controls. Cleavage (D2), blastocyst (D7) and pregnancy (D30) rates were analyzed by the χ2 test, for P < 0.05...(AU)

Effectiveness of microwell-based in vitro culture systems for zona-free cloned bovine embryos

Background: Modified embryo in vitro culture (IVC) systems have been devised for the culture of individual embryos, suchas in microdroplets, capillary tubes, or co-cultures systems. However, the development of the Well-of-the-Well (WOW)system takes advantage of both the individual and the grouped culture systems, as embryos are cultured into microwellsdisposed into a larger well. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo developmental potential of handmade cloning (HMC)-derived cloned bovine embryos after the IVC in three microwell (WOW) systems.Material, Methods & Results: Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) isolated after subcutaneous biopsy from a Nellore adult female were used as nucleus donor cells for cloning. Collected adipose tissue was incubated in0.075% collagenase for 60 min at 39oC. After digestion, cell suspension was centrifuged at 80 g for 10 min, supernatantwas discarded, and 2 mL of Red Blood Cells Lysis Buffer (RBC) was added to the pellet, remaining for 2 min. The RBCbuffer was diluted with 20 mL PBS, with cell suspension spun at 80 g for 5 min. Supernatant was discarded and the pelletre-suspended in DMEM culture medium + 10% fetal calf serum (FCS). Following cell counting, 5 x 105 cells were seededin 25-cm² bottles containing 6 mL DMEM + 10% FCS, and cultured at 38.3°C, 5% CO2 in air and saturated humidity.After IVM, oocytes were denuded and incubated in demecolcine, followed by zona pellucida removal, oocyte bisection,embryo reconstruction, electrofusion and chemical activation. Cloned embryos were allocated to one of three IVC groups:cWOW: conventional microwells (250 µm, round); mWOW: modified microwells (130 µm, conical); and WOW-PDMS:microwells in polydimethylsiloxane chips (170 µm, cylindrical, with interconnecting microchannels); IVF embryos wereused as controls. Cleavage (D2), blastocyst (D7) and pregnancy (D30) rates were analyzed by the χ2 test, for P < 0.05...

Morphology and morphometry of feline bone marrow-derived mesenchymal stem cells in culture / Morfologia e morfometria das células-tronco mesenquimais isoladas de medula óssea de gato

Mesenchymal stem cells (MSC) are increasingly being proposed as a therapeutic option for treatment of a variety of different diseases in human and veterinary medicine. Stem cells have been isolated from feline bone marrow, however, very few data exist about the morphology of these cells and no data were found about the morphometry of feline bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs). The objectives of this study were the isolation, growth evaluation, differentiation potential and characterization of feline BM-MSCs by their morphological and morphometric characteristics. in vitro differentiation assays were conducted to confirm the multipotency of feline MSC, as assessed by their ability to differentiate into three cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes). To evaluate morphological and morphometric characteristics the cells are maintained in culture. Cells were observed with light microscope, with association of dyes, and they were measured at 24, 48, 72 and 120h of culture (P1 and P3). The non-parametric ANOVA test for independent samples was performed and the means were compared by Tukey's test. On average, the number of mononuclear cells obtained was 12.29 (±6.05x10(6)) cells/mL of bone marrow. Morphologically, BM-MSCs were long and fusiforms, and squamous with abundant cytoplasm. In the morphometric study of the cells, it was observed a significant increase in average length of cells during the first passage. The cell lengths were 106.97±38.16µm and 177.91±71.61µm, respectively, at first and third passages (24 h). The cell widths were 30.79±16.75 µm and 40.18±20.46µm, respectively, at first and third passages (24 h).The nucleus length of the feline BM-MSCs at P1 increased from 16.28µm (24h) to 21.29µm (120h). However, at P3, the nucleus length was 26.35µm (24h) and 25.22µm (120h). This information could be important for future application and use of feline BM-MSCs.(AU)

As células tronco mesenquimais são utilizadas na terapia de várias doenças na medicina humana e veterinária. As células tronco foram isoladas da medula óssea de gato, entretanto, existem poucos dados referentes a morfologia e não existem informações sobre a morfometria das células tronco isoladas da medula óssea. Os objetivos do presente estudo foram o isolamento, avaliação do crescimento, potencial de diferenciação e caracterização morfológica e morfométrica das células mesenquimais de gato isoladas de medula óssea. A diferenciação in vitro foi realizada para confirmar a multipotencialidade das células mesenquimais de gato (diferenciação em osteoblastos, condrócitos, adipócitos). As células mesenquimais foram mantidas em cultivo para avaliações morfológica e morfométrica. As células foram coradas e observadas em microscopia ótica. As mensurações foram realizadas com 24, 48, 72 e 120h de cultura (primeira e terceira passagens). O teste não paramétrico ANOVA foi utilizado e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O número médio de células mononucleares obtido foi de 12,29 (±6,05x10(6)) células/mL de medula óssea. As células mesenquimais são longas e fusiformes, e escamosas com citoplasma abundante. No estudo morfométrico, observou-se aumento no comprimento médio das células durante a primeira passagem. As medidas de comprimento das células foram: 106,97±38,16µm e 177,91±71,61µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). As medidas de largura das células foram: 30,79±16,75 µm e 40,18±20,46 µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). O comprimento do núcleo na primeira passagem aumentou de 16,28µm (24h) para 21,29µm (120h) e na terceira passagem foi de 26,35µm (24h) para 25,22µm (120h). As informações são importantes para futuras aplicações e uso da célula mesenquimal de gato.(AU)

Morphology and morphometry of feline bone marrow-derived mesenchymal stem cells in culture / Morfologia e morfometria das células-tronco mesenquimais isoladas de medula óssea de gato

Mesenchymal stem cells (MSC) are increasingly being proposed as a therapeutic option for treatment of a variety of different diseases in human and veterinary medicine. Stem cells have been isolated from feline bone marrow, however, very few data exist about the morphology of these cells and no data were found about the morphometry of feline bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs). The objectives of this study were the isolation, growth evaluation, differentiation potential and characterization of feline BM-MSCs by their morphological and morphometric characteristics. in vitro differentiation assays were conducted to confirm the multipotency of feline MSC, as assessed by their ability to differentiate into three cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes). To evaluate morphological and morphometric characteristics the cells are maintained in culture. Cells were observed with light microscope, with association of dyes, and they were measured at 24, 48, 72 and 120h of culture (P1 and P3). The non-parametric ANOVA test for independent samples was performed and the means were compared by Tukey's test. On average, the number of mononuclear cells obtained was 12.29 (±6.05x106) cells/mL of bone marrow. Morphologically, BM-MSCs were long and fusiforms, and squamous with abundant cytoplasm. In the morphometric study of the cells, it was observed a significant increase in average length of cells during the first passage. The cell lengths were 106.97±38.16µm and 177.91±71.61µm, respectively, at first and third passages (24 h). The cell widths were 30.79±16.75 µm and 40.18±20.46µm, respectively, at first and third passages (24 h).The nucleus length of the feline BM-MSCs at P1 increased from 16.28µm (24h) to 21.29µm (120h). However, at P3, the nucleus length was 26.35µm (24h) and 25.22µm (120h). This information could be important for future application and use of feline BM-MSCs.(AU)

As células tronco mesenquimais são utilizadas na terapia de várias doenças na medicina humana e veterinária. As células tronco foram isoladas da medula óssea de gato, entretanto, existem poucos dados referentes a morfologia e não existem informações sobre a morfometria das células tronco isoladas da medula óssea. Os objetivos do presente estudo foram o isolamento, avaliação do crescimento, potencial de diferenciação e caracterização morfológica e morfométrica das células mesenquimais de gato isoladas de medula óssea. A diferenciação in vitro foi realizada para confirmar a multipotencialidade das células mesenquimais de gato (diferenciação em osteoblastos, condrócitos, adipócitos). As células mesenquimais foram mantidas em cultivo para avaliações morfológica e morfométrica. As células foram coradas e observadas em microscopia ótica. As mensurações foram realizadas com 24, 48, 72 e 120h de cultura (primeira e terceira passagens). O teste não paramétrico ANOVA foi utilizado e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O número médio de células mononucleares obtido foi de 12,29 (±6,05x106) células/mL de medula óssea. As células mesenquimais são longas e fusiformes, e escamosas com citoplasma abundante. No estudo morfométrico, observou-se aumento no comprimento médio das células durante a primeira passagem. As medidas de comprimento das células foram: 106,97±38,16µm e 177,91±71,61µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). As medidas de largura das células foram: 30,79±16,75 µm e 40,18±20,46 µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). O comprimento do núcleo na primeira passagem aumentou de 16,28µm (24h) para 21,29µm (120h) e na terceira passagem foi de 26,35µm (24h) para 25,22µm (120h). As informações são importantes para futuras aplicações e uso da célula mesenquimal de gato.(AU)

Avaliação da interação biológica entre compósito de nanotubo de carbono, quitosana e hidroxiapatita e tecido ósseo São Paulo 2019

Atualmente têm se desenvolvido substitutos ósseos, com propósito de auxiliar na regeneração óssea em casos de perda tecidual. Para avaliação da biocompatibilidade e osteocondução, é necessária sua implantação in vivo, em animais de laboratório e grandes animais, para aprovação em uso clínico futuro. Ratos e ovinos são modelos experimentais em engenharia tecidual. Podem ser adicionados aos biomateriais, células-tronco mesenquimais para potencialização do efeito regenerativo ósseo. O objetivo desse estudo foi avaliar a biocompatibilidade e osteocondução de compósito de nanotubo de carbono, quitosana e hidroxiapatita (CNQH), enriquecidos ou não com células-tronco mesenquimais oriundas de medula óssea de ovino (CTMO) em ratos e ovinos. Inicialmente, sessenta ratos foram divididos em grupos, sendo que o implante de CNQH com ou sem CTMO, em subcutâneo, foi realizado em 20 animais (submetidos a eutanásia após 7 e 30 dias da cirurgia), comparando com 10 animais controle, e em 20 animais em defeito na calvária (submetidos a eutanásia após 20 e 60 dias da cirurgia) comparando com 10 animais controle. Foram realizadas avaliações histológicas de tecido subcutâneo e calvária, após eutanásia, comparando-se os grupos. Posteriormente, dezoito ovelhas foram submetidas à ostectomia em tíbia e osteossíntese com placa de compressão bloqueada. Seis animais não tiveram suas falhas preenchidas (Grupo I), seis animais tiveram suas falhas preenchidas com CNQH (Grupo II) e seis animais com CNQH com CTMO (Grupo III), sendo avaliados até 90 dias após a cirurgia. No período pré e pósoperatório (30, 60 e 90 dias) os animais foram submetidos às avaliações radiográficas, sendo as imagens analisadas em relação a efetividade da osteossíntese e a preenchimento da falha por escore, comparando-se os grupos. Após 90 dias, as ovelhas foram submetidas à eutanásia. Observou-se ausência de sinais de toxicidade ou necrose em subcutâneo dos ratos, denotando a biocompatibilidade do compósito e não reação imunogênica às CTMO. A análise histomorfológica por escore da calvária dos ratos demonstrou, em relação ao infiltrado inflamatório que o Grupo Controle apresentou escores mais baixos que os demais grupos, somente aos 20 dias, denotando a diminuição da reação inflamatória ao longo do tempo. O Grupo Controle apresentou pontuações mais baixas de escore aos 20 e 60 dias, para tecido de granulação e neoformação óssea, respectivamente, em relação aos grupos com compósito, que não apresentaram diferenças estatísticas significativas, sugerindo que o compósito auxiliou no processo regenerativo dos defeitos em calvária. Nas avaliações radiográficas em ovinos, os escores de preenchimento de falha nos Grupo I foi menor ao longo do tempo em relação aos Grupos II e III, que apresentaram escores semelhantes. As avaliações histológicas no tecido ósseo de ovinos demonstraram ausência de tecido ósseo neoformado em Grupo I e nos Grupos II e III ausência de reação de corpo estranho, com trabéculas ósseas de tecido neoformado entremeadas ao compósito, em conectividade com tecido pré-existente. Na histomorfometria dos Grupos II e III, observou-se porcentagens semelhantes em relação de tecido ósseo neoformado. Foi possível concluir que o CNQH apresenta biocompatibilidade e perfil osteocondutor para ser utilizado como coadjuvante em casos de perda tecidual óssea.

Research on bone substitutes and bone healing enhancers for critical defects has expanded considerably in recent years. Pre-clinical evaluation of biocompatibility and the osteoconductive potential using in vivo animal models is paramount. Sheep and rats are considered standard models in tissue engineering. Enhancement of bone regeneration can be achieved by using mesenchymal stem cells. The purpose of this study was to evaluate the biocompatibility and osteoconductivity of carbon nanotube/chitosan/hydroxyapatite (CNT/CS/HA) composite scaffolds enriched or not with ovine bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) in murine and ovine models. Initially, sixty rats were divided into 2 groups. The CNT/CS/HA composites with or without (MSCs) were implanted in the subcutaneous tissue of 20 animals (euthanized 7 and 30 days after surgical implantation). They were compared to 10 control animals. The CNT/CS/HA composites with or without (MSCs) were also implanted in the calvarial bone defects of another 20 rats (euthanized 20 and 60 days after surgical implantation). They were compared to 10 control animals. Post-mortem histology examinations were performed to compare results between subcutaneous and calvarial tissue groups. At a second moment, we performed tibial ostectomy on eighteen sheep followed by osteosynthesis using locked compression plate. The bone void was left empty on six animals (Group I), filled with CNT/CS/HA on six animals (Group II), and filled with CNT/CS/HA enhanced with MSCs on six animals (Group III). Assessment was performed up to 90 days after surgery. Radiographic assessments were performed before surgery and on days 30, 60 and 90 after surgery. Effectiveness of osteosynthesis and void filling score were compared between groups. The animals were euthanized 90 days after surgery. On post-mortem evaluation the rats subcutaneous tissues were free of any toxicity signs or necrosis. The absence of immunogenic reactions to MSCs denotes the composites biocompatibility. Histomorphological analysis of the rat calvarial score (considering inflammatory infiltrate) showed that Control Group presented lower scores only at the assessment performed on the 20th day after surgery. This finding denotes a decrease trend on the inflammatory reaction over time. Animals from Control Group had lower granulation tissue and bone neoformation scores at days 20 and 60, respectively, when compared to composite groups. Lack of statistically significant differences suggest that the composite material assisted the regeneration of the calvarial defects. On radiographic assessment of the sheep, the void filling scores of Group I were lower than Groups II and III over time. Groups II and III had similar scores. Histological evaluations of the sheeps bone tissues denoted absence of bone neoformation in Group I. Foreign body reaction was not encountered on Groups II and III. Newly formed bone trabeculae entangled to composite and connected to pre-existing tissue were observed. Histomorphometry analysis showed similar newly formed bone tissue ratios in Groups II and III. We concluded the CNT/CS/HA composite is biocompatible and has osteoconductive profile that enables its use as bone enhancer in cases of critical sized bone defects causes by bone tissue loss.

Uso de culturas de células tronco mesenquimais de ratos como modelo para elucidar a patogênese da metaplasia óssea e das alterações ósseas induzidas pela intoxicação por Solanum glaucophyllum

As plantas calcinogênicas têm importância na medicina veterinária mundial por conterem glicosídeos, que após a sua ingestão, liberam metabólitos da vitamina D, potencialmente nocivos. No Brasil, as espécies Solanum glaucophyllum (S. malacoxylon) e Nierembergia veitchii são responsáveis pela calcinose enzoótica, intoxicação de caráter endêmico que acomete ruminantes. A calcinose é caracterizada pela calcificação de tecidos moles e está frequentemente associada à metaplasias óssea e cartilaginosa. A hipótese do primeiro experimento é que as células tronco mesenquimais (CTMs) estejam envolvidas na gênese do processo de metaplasia óssea causado pela S. glaucophyllum, o que ainda carece de comprovação científica. Além da metaplasia, a intoxicação pela S. glaucophyllum causa alterações ósseas, representadas por osteopetrose, osteonecrose e osteoporose. Por ser o osteoblasto uma célula que deriva da diferenciação osteogênica das CTMs da medula óssea, a hipótese do segundo experimento é que a osteoporose induzida pela intoxicação por S. glaucophyllum seja decorrente não somente da ação da planta sobre os osteoblastos, como também do seu efeito sobre a diferenciação osteogênica das CTMs. A concentração de 1,25(OH)2D3 obtida, por meio da técnica de cromatografia líquida, no extrato da planta foi de 3,8 µg/mL. Em ambos os experimentos, foram testados os efeitos de 100µL, 1mL e 50mL de extrato/L, contendo respectivamente, 1nM (0,4 µg/L), 10nM (4 µg/L) e 50nM (20 µg/L) de 1,25(OH)2D3. Foram realizados os seguintes ensaios: ensaio de MTT, atividade de fosfatase alcalina, determinação da porcentagem de células por campo, número de nódulos de mineralização e avaliação da expressão dos transcritos gênicos para osteopontina, sialoproteína óssea e BMP-2, por RT-PCR tempo real. No primeiro experimento, culturas de CTMs da medula óssea foram utilizadas como modelo para estudo dos efeitos da S. glaucophyllum na indução da diferenciação osteogênica de células indiferenciadas. Na concentração de 5mL de extrato de S. glaucophyllum por L de cultura desprovido de fatores indutores da osteogênese, o extrato da planta induziu diferenciação osteogênica das CTMs, comprovada pela maior síntese de matriz mineralizada e pelo aumento da expressão relativa dos transcritos gênicos para BMP-2. A diferenciação osteogênica induzida pelo extrato da planta foi estatisticamente semelhante à diferenciação induzida por meio de cultura contendo fatores que comprovadamente induzem osteogênese, representados pelo -glicerofosfato, ácido ascórbico e pela dexametasona. Conclui-se que culturas de CTMs da medula óssea de ratos são um bom modelo para estudar o efeito do extrato da S. glaucophyllum sobre a diferenciação osteogênica de células indiferenciadas e que os extratos de S. glaucophyllum contendo 10nM (4 µg/L) e 50nM (20 µg/L) de 1,25(OH)2D3 causam diferenciação osteogênica de CTMs, sugerindo ser este um dos mecanismos pelo qual a S. glaucophyllum produz metaplasia óssea. No segundo experimento, a fim de estudar os efeitos da S. glaucophyllum em CTMs submetidas à diferenciação em osteoblastos, diferentes concentrações do extrato da planta foram adicionadas ao meio de cultura, juntamente com fatores conhecidamente promotores de diferenciação osteogênica, representados pelo -glicerofosfato, ácido ascórbico e pela dexametasona. Aos 21 dias, nas concentrações de 1mL e de 5mL de extrato/L, houve redução significativa do número e do tamanho dos nódulos de mineralização, respectivamente. A concentração de 5mL de extrato/L também reduziu significativamente a expressão do transcrito para osteopontina em comparação ao controle. Conclui-se que o extrato de S. glaucophyllum apresenta efeito negativo sobre culturas de CTMs comprometidas com a diferenciação osteogênica, o que sugere ser este um dos mecanismos pelo qual ocorre osteoporose nos animais intoxicados pela planta

Calcinogenic plants are important in veterinary medicine worldwide because they contain glycosides, which after their ingestion release potentially harmful vitamin D metabolites. In Brazil, the species Solanum glaucophyllum (S. malacoxylon) and Nierembergia veitchii are responsible for enzootic calcinosis, endemic intoxication that affects ruminants. Calcinosis is characterized by soft tissue calcification and is often associated with bone and cartilaginous metaplasias. The hypothesis of the first experiment is that the mesenchymal stem cells (MSCs) are involved in the genesis of the bone metaplasia caused by S. glaucophyllum, which still lacks scientific proof. In addition to metaplasia, S. glaucophyllum intoxication causes bone changes, represented by osteopetrosis, osteonecrosis and osteoporosis. Because the osteoblast is a cell derived from osteogenic differentiation of bone marrow MSCs, the hypothesis of the second experiment is that osteoporosis induced by S. glaucophyllum intoxication arises not only from the action of the plant on osteoblasts, but also from its effect on the osteogenic differentiation of MSCs. The concentration of 1,25(OH)2D3 obtained in the liquid chromatography technique in the extract of the plant was 3.8 g/mL. In both experiments, the effects of 100L, 1mL and 5mL of extract per liter of medium with 1nM (0.4g/L), 10nM (4g/L) and 50nM (20g/L) of 1,25(OH)2D3, respectivelly, were tested. The following assays were performed: MTT assay, alkaline phosphatase activity, determination of cells per field percentage, number of mineralization nodules and evaluation of the expression of the gene transcripts for osteopontin, bone sialoprotein and BMP-2 by RT -PCR real-time. In the first experiment, bone marrow MSCs cultures were used as a model for the study of the effects of S. glaucophyllum on the induction of osteogenic differentiation of undifferentiated cells. In the concentration of 5mL of S. glaucophyllum extract per liter of culture medium lacking osteogenesis inducing factors, the plant extract induced osteogenic differentiation of the MSCs, evidenced by the increase of mineralized matrix and relative expression of the gene transcripts to BMP-2. The osteogenic differentiation induced by the plant extract was statistically similar to the differentiation induced by culture containing factors that proved to induce osteogenesis, represented by -glycerophosphate, ascorbic acid and dexamethasone. It is concluded that rat bone marrow MSCs cultures are a good model for studying the effect of S. glaucophyllum extract on osteogenic differentiation of undifferentiated cells and that S. glaucophyllum extracts containing 10nM (4 g/L) and 50nM (20 g/L) of 1,25(OH)2D3 causes osteogenic differentiation of MSCs, suggesting that this is one of the mechanisms by which S. glaucophyllum produces bone metaplasia. In the second experiment, in order to study the effects of S. glaucophyllum on MSCs undergoing differentiation in osteoblasts, different concentrations of the plant extract were added to the culture medium, together with factors known to promote osteogenic differentiation, represented by -glycerophosphate, ascorbic acid and dexamethasone. At 21 days, in the concentrations of 1mL and 5mL of extract/L, there was a significant reduction in the number and size of mineralization nodules, respectively. The concentration of 5mL extract/L also significantly reduced transcript expression for osteopontin compared to control. It is concluded that the extract of S. glaucophyllum has a negative effect on cultures of mesenchymal stem cells compromised by osteogenic differentiation, suggesting that this is one of the mechanisms by which osteoporosis occurs in animals intoxicated by the plant

CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ALÓGENAS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO NAS OSTEOSSÍNTESES MINIMAMENTE INVASIVAS NA TÍBIA DE CÃES

O tratamento das fraturas, especialmente aquelas causadas por traumas de alta energia, permanece como grande desafio ao cirurgiões médicos e veterinários. A busca por terapias adjuvantes, assim como técnicas que possam aprimorar os índices de sucesso, é fundamental na minimização das potenciais complicações. O objetivo desse estudo foi avaliar a reparação óssea após a realização da técnica de osteossíntese minimamente invasiva com placa (MIPO) associada à aplicação percutânea, no foco de fratura, de células-tronco mesenquimais alógenas derivadas de tecido adiposo (CTM-AD), em fraturas de tíbia de cães e posteriormente, comparar com a aplicação percutânea de concentrado de medula óssea autóloga. Foram utilizados 29 cães que apresentaram fraturas completas e fechadas da tíbia, as quais foram tratadas com MIPO e aplicação percutânea, no foco de fratura, de 3 milhões de CTM-AD alógenas ou 2 mL de concentrado de medula óssea autóloga (MO). Os exames radiográficos foram realizados no momento imediato após a cirurgia e 15, 30, 60, 90 e 120 dias pós-operatórios e avaliados quanto à aposição dos fragmentos, presença de desvios angulares, evolução da união óssea e complicações. A análise dos resultados dos 20 cães do grupo CTM-AD mostrou que a aposição dos fragmentos foi boa em 60% dos casos, adequada em 35% dos casos e inaceitável em 5% dos casos. O tempo médio de união clínica radiográfica foi de 28 ± 12,8 dias. Em 60% dos casos foi observada reação periosteal moderada, demonstrando organizada atividade osteogênica no foco de fratura com 15 dias de pós-operatório. Somente em 1 caso (5%) ocorreram desvios angulares moderados após a fixação da fratura, porém sem repercussões clínicas. Complicações menores incluíram seroma (5%) e soltura de um parafuso (10%), e complicações maiores incluíram a inserção do parafuso mais proximal no espaço articular do joelho (10%). Em relação à comparação entre as CTM-AD e MO, o tempo mediano de união radiográfica entre os grupos foi similar (30 dias). Entretanto, na escala de união radiográfica (RUST) das radiografias de 30 dias de pós-operatório, o grupo CTM-AD apresentou escore final médio superior (p<0,05). Conclui-se que a associação da terapia celular com CTM-AD alógena e MIPO se mostrou uma alternativa viável, eficaz e segura em promover a reparação óssea em fraturas não articulares de tíbia em cães.

Treating fractures, especially those caused by high energy trauma, remains a major challenge to medical and veterinary surgeons. Adjuvant therapies as well as techniques that can improve success rates are fundamental at minimizing potential complications. The aim of this study was to evaluate bone healing after minimally invasive plate osteosynthesis (MIPO) associated with percutaneous application, in the fracture site, of allogenic adipose derived mesenchymal stem cells (AD-MSC), in the tibia of dogs, and then, to compare with an application of autologous bone marrow concentrate (BMC). Twenty-nine dogs with complete and closed tibial fractures were used, which were treated with MIPO and percutaneous application of 3 million allogeneic AD-MSC or 2 mL of autologous BMC. Radiographic examinations were performed immediately after surgery and 15, 30, 60, 90 and 120 postoperatively. Fragments apposition, angular and rotational deviations, bone union evolution and complications were evaluated. Apposition was considered good in 60% of cases, adequate in 35% and unacceptable in 5%. The mean radiographic union time was 28 ± 12.8 days. In 60% of the cases, a moderate periosteal reaction was observed, showing organized osteogenic activity at the fracture site 15 days postoperatively. In only 1 case (5%), moderate angular deviations occurred after fracture fixation, but without clinical issues. Minor complications included seroma (5%) and a screw pullout (10%), and major ones included an insertion of the most proximal screw in the joint space of the knee (10%). Regarding the comparison between AD-MSC and BMC, median time of radiographic union between groups was similar (30 days). However, in the radiographic union scale (RUST) of the 30th day postoperative radiographs, the CTM-AD group had a superior final mean score (p <0.05). In conclusion, the association of cell therapy with AD-MSC and MIPO seems to be a feasible and effective alternative to improve bone healing in non-articular tibial fractures in dogs.

Avaliação da progressão da taxa de filtração glomerular pela dimetilarginina simétrica em cães com doença renal crônica submetidos à terapia com células-tronco mesenquimais

A doença renal crônica ocorre pelo comprometimento funcional e/ou estrutural de um ou ambos os rins e apresenta caráter irreversível e progressivo. A taxa de filtração glomerular é a medida que melhor avalia a função renal e apresenta boa correlação com a gravidade da DRC, porém fatores como custo e técnica podem limitar sua realização. A creatinina sérica (sCr) é o biomarcador indireto utilizado na rotina clínica que mais de aproxima da TFG, porém sua interpretação deve ser cuidadosa pois esta é influenciada por fatores extrarrenais. Além disso, a azotemia só é observada quando cerca de 75% da massa de néfrons já foi perdida, correspondendo à diminuição de 50-60% da função renal. Neste ponto, a terapia torna-se limitada, e cães com DRC nos estágios mais avançados apresentam mau prognóstico. A dimetilarginina simétrica (SDMA), um novo biomarcador indireto de taxa de filtração glomerular (TFG), demonstrou boa correlação com a sCr e com a TFG, bem como maior precocidade em identificar alterações de função glomerular. Em 2016, a IRIS (International Renal Interest Society) incluiu em suas diretrizes para estagiamento da DRC a mensuração da SDMA. Devido à terapia atual para DRC ser limitada ao manejo conservador, a terapia com células-tronco tem demonstrado potencial de uso por apresentar efeito renoprotetor, associado à sua ação imunomoduladora. Uma fonte de células-tronco mesenquimais (CTM) é o cordão umbilical, estas células embora já adultas são ainda bem jovens, apresentando boa alternativa para uso em terapia. Este estudo avaliou sequencialmente, pelo período de 12 meses (ou óbito), 27 cães com DRC estágios 2 (Grupo A) e 3 (Grupo B). Ambos foram divididos entre grupos que receberam terapia com CTM (Grupo A CTM, n = 6 e Grupo B CTM, n = 8) e aqueles que receberam apenas solução fisiológica, controle (Grupo A SF, n = 6; Grupo B SF, n = 7). Foram avaliadas mensalmente (± 15 dias) a concentração de sCr e trimestralmente (± 20 dias) a SDMA sérica. Não foi possível identificar alterações das concentrações de SDMA ou sCr com o uso das CTM, ao longo do acompanhamento, no Grupo A (P = 0,3198 e P = 0,9035, respectivamente) ou no Grupo B (P = 0,7640 e P = 0,2306, respectivamente). Associa-se isso à heterogeneidade dos cães no estágio 3, havendo a possibilidade ainda da necessidade de maior tempo de acompanhamento (muitos cães evoluíram a óbito), bem como maior número de animais avaliados em cada grupo. SDMA apresentou correlação moderada com sCr (r = 0,6186; p < 0,0001), suas concentrações no entanto, apresentam variações individuais cuja causa ainda é pouco conhecida, assim a importância da avaliação sequencial. Mau prognóstico foi observado quanto maior a concentração de SDMA.

Chronic kidney disease (CKD) is characterized by functional and/or structural impairment of one or both kidneys and this impairment is irreversible and progressive. The glomerular filtration rate (GFR) is the best assessment of renal function and well correlates with CKD severity but factors such as cost and technique may limit its achievement. Serum creatinine (sCr) is the indirect biomarker most used in clinic routine showing a good correlation with GFR, but its interpretation must be careful since it can be influenced by extra-renal factors. In addition, azotemia is only observed when about 75% of nephron mass has already been lost, corresponding to 50-60% decreased renal function. At this point therapy becomes limited and dogs in an advanced CKD stage present poor prognosis. Symmetric dimethylarginine is a new GFR indirect biomarker that has shown a good correlation with sCr and GFR and an earlier recognition of renal function when compared to sCr. In 2016 the International Renal Interest Society included a preliminary staging based on SDMA in the IRIS CKD guidelines. Current CKD therapy is limited to conservative management, so mesenchymal stem cell (MSC) renoprotective effect associated to an immunomodulatory action has been studied as a possible therapy. The umbilical cord is a rich source of MSC and these are young cells what contributes to a better response to therapy. This study sequentially evaluated for a 12-month period (or death), 27 dogs in CKD stages 2 (Group A) and 3 (Group B). Both were divided into groups that received MSC therapy (Group A - MSC, n = 6 and Group B - MSC, n = 8) and those receiving only physiological solution, control group (Group A - PS, n = 6; Group B - PS, n = 7). The concentration of sCr was monthly assessed (± 15 days) and SDMA was evaluated each three months (± 20 days). It was not possible to identify changes in SDMA or sCr concentrations with MSC therapy during the followup in Group A (P = 0.3198 and P = 0.9035, respectively) or in Group B (P = 0.7640 and P = 0.2306, respectively). This may be associated with the heterogeneity of dogs in stage 3, with a need of longer follow-up period (many dogs died during the study), as well as higher number of animals evaluated in each group. SDMA presented a moderate correlation with sCr (r = 0.6186; P < 0.0001); however, their concentrations have individual variations whose cause is still not well known, so the importance of sequential evaluation. Poor prognosis was observed when the concentration of SDMA was higher.