Curcumin alleviated oxidation stress injury by mediating osteopontin in nephrolithiasis rats

Purpose: To explore the role and mechanism of curcumin (Cur) in reducing oxidative stress damage in rats with nephrolithiasis induced by ethylene glycol (EG). Methods: Thirty male rats were divided into normal control, model, positive (10% potassium citrate), Cur-10 (10 mg/kg curcumin) and Cur-20 (20 mg/kg curcumin) groups. Results: The results of kidney tissue section stained by hematoxylin-eosin and von Kossa showed that curcumin treatment can inhibit the formation of kidney stones. The biochemical test results showed that the urea (Ur), creatinine (Cr), uric acid (UA), inorganic phosphorus and Ca2+ concentrations in urine decreased after being treated with curcumin. There were significant differences between different doses of curcumin (P < 0.05). Compared with the Cur-10 group, Cur-20 had a more significant inhibitory effect on malondialdehyde (MDA) (P < 0.05). In addition, reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) detection and immunohistochemical results indicated that the osteopontin (OPN) in the kidney was significantly reduced after curcumin treatment. Conclusion: Curcumin could reduce the oxidative stress damage caused by EG-induced kidney stones.

New antioxidant lauryl-free herbal shampoo formulation with a Brazilian plant extract / Nova formulação de xampu herbal antioxidante e sem lauril com extrato de planta brasileira

Sodium lauryl sulfate is the main cleaning ingredient in shampoos, even though it may be potentially damaging to hair. The demand for antioxidant-rich cosmetics, on the other hand, has encouraged green cosmetics research. Brazil has vast biodiversity that can be exploited for the production of these cosmetics. This work aimed to develop a minimalist antioxidant lauryl-free shampoo formulation with leaf extracts from the Brazilian plant Hancornia speciosa Gomes. Two hydroethanolic extracts were prepared using different extraction methods, Soxhlet, and ultrasound. The extracts were characterized by the presence of saponins, polyphenol quantification, and HLPC chemical identification of the compounds. Antioxidant activity was determined using the DPPH method. The antioxidant lauryl-free shampoo was developed using hydroxyethyl cellulose with two concentrations of leaf extract obtained by Soxhlet, 0.125 mg/g (XP1) and 0.250 mg/g (XP2). Along with the antioxidant activity, the physical and chemical properties, cleaning potential, and foam quality were evaluated. The Soxhlet leaf extract revealed a more favorable chemical profile, including a positive result for saponins, as well as a larger quantity of polyphenols and increased antioxidant activity. The XP2 formulation showed better foam height, dirt dispersion, and antioxidant activity. Thus, the use of mangabeira leaf extract appears to be promising for the development of shampoos with antioxidant activity.

O lauril sulfato de sódio é o principal ingrediente de limpeza em xampus, embora possa ser potencialmente prejudicial ao cabelo. A demanda por cosméticos ricos em antioxidantes, por outro lado, tem incentivado as pesquisas com cosméticos verdes. O Brasil possui uma vasta biodiversidade que pode ser explorada para a produção desses cosméticos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma formulação de xampu antioxidante minimalista sem lauril com extratos de folhas da planta brasileira Hancornia speciosa Gomes. Dois extratos hidroetanólicos foram preparados usando diferentes métodos de extração, Soxhlet e ultrassom. Os extratos foram caracterizados quanto à presença de saponinas, quantificação de polifenóis e identificação química HLPC dos compostos. A atividade antioxidante foi determinada pelo método DPPH. O xampu antioxidante sem lauril foi desenvolvido utilizando hidroxietil celulose com duas concentrações de extrato de folha obtido por Soxhlet, 0.125 mg/g (XP1) e 0.250 mg/g (XP2). Juntamente com a atividade antioxidante, foram avaliadas as propriedades físicas e químicas, potencial de limpeza e qualidade da espuma. O extrato da folha de Soxhlet revelou um perfil químico mais favorável, incluindo resultado positivo para saponinas, além de maior quantidade de polifenóis e aumento da atividade antioxidante. A formulação XP2 apresentou melhor altura de espuma, dispersão de sujeira e atividade antioxidante. Assim, o uso do extrato da folha de mangabeira parece ser promissor para o desenvolvimento de xampus com atividade antioxidante.

Ultraestrutura e criopreservação de sêmen de jundiá amazônico (Leiarius marmoratus) em cativeiro / Ultrastructure and sperm cryopreservation of the amazon catfish (Leiarius marmoratus) in captivity

Os objetivos do presente estudo foram analisar a ultraestrutura do espermatozoide do jundiá amazônico e avaliar a sua criopreservação com três agentes crioprotetores (metanol 10%, DMSO 10% e etilenoglicol 10%) e duas soluções ativadoras (NaCl 0,29% e NaHCO3 1%). Como diluente, foi utilizada uma solução de glicose a 5%, sendo o sêmen envasado em palhetas de 0,25mL e congelado em vapor de nitrogênio (botijão dry shipper). No sêmen fresco, o espermatozoide apresentou comprimento de 25,46±2,54µm, cabeça esférica (1,51±0,18µm), ausência de acrossoma, peça intermediária com formato cônico (0,93±0,17µm), ligeiramente assimétrica, com presença de vesículas, e flagelo único (21,48±2,45µm). O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (P<0,05) para duração, vigor e taxa de motilidade espermática com os crioprotetores metanol 10% e DMSO 10%. A duração da motilidade espermática foi maior (P<0,05) com o ativador NaHCO3 1% (21-96 s). O sêmen de Leiarius marmoratus criopreservado com DMSO e metanol apresentou, respectivamente, 7,32±4,21% e 8,94±6,69% de taxa de motilidade. No entanto, os resultados não foram satisfatórios para estabelecer um protocolo para a espécie.(AU)

The aims of this study were to describe the spermatozoon ultrastructure and to evaluate the sperm cryopreservation of the amazon catfish with three cryoprotectant agents (10% methanol, 10% DMSO, and 10% ethylene glycol) and two activator agents (0.29% NaCl and 1% NaHCO3). Glucose 5% extender was used as a diluent solution and sperm loaded in 0.25 straws was frozen in nitrogen vapor (dry shipper). Fresh spermatozoon was 25.46±2.54µm long, the head was spherical (1.51±0.18µm) with no acrosome, the midpiece was cone shaped (0.93±0.17µm) with presence of vesicles, slightly asymmetric, and the flagellum was single (21.48±2.45µm). Post-thawed semen presented higher values (P< 0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO. The duration of sperm motility was longer (P< 0,05) when triggered in 1% NaHCO3 (96-21 s). Leiarius marmoratus semen cryopreserved with DMSO and methanol, presented respectively 7.32±4.21% and 8.94±6.69% of motility. However, the results were not satisfactory to establish a protocol for the specie.(AU)

Ultraestrutura e criopreservação de sêmen de jundiá amazônico (Leiarius marmoratus) em cativeiro / Ultrastructure and sperm cryopreservation of the amazon catfish (Leiarius marmoratus) in captivity

Os objetivos do presente estudo foram analisar a ultraestrutura do espermatozoide do jundiá amazônico e avaliar a sua criopreservação com três agentes crioprotetores (metanol 10%, DMSO 10% e etilenoglicol 10%) e duas soluções ativadoras (NaCl 0,29% e NaHCO3 1%). Como diluente, foi utilizada uma solução de glicose a 5%, sendo o sêmen envasado em palhetas de 0,25mL e congelado em vapor de nitrogênio (botijão dry shipper). No sêmen fresco, o espermatozoide apresentou comprimento de 25,46±2,54µm, cabeça esférica (1,51±0,18µm), ausência de acrossoma, peça intermediária com formato cônico (0,93±0,17µm), ligeiramente assimétrica, com presença de vesículas, e flagelo único (21,48±2,45µm). O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (P<0,05) para duração, vigor e taxa de motilidade espermática com os crioprotetores metanol 10% e DMSO 10%. A duração da motilidade espermática foi maior (P<0,05) com o ativador NaHCO3 1% (21-96 s). O sêmen de Leiarius marmoratus criopreservado com DMSO e metanol apresentou, respectivamente, 7,32±4,21% e 8,94±6,69% de taxa de motilidade. No entanto, os resultados não foram satisfatórios para estabelecer um protocolo para a espécie.(AU)

The aims of this study were to describe the spermatozoon ultrastructure and to evaluate the sperm cryopreservation of the amazon catfish with three cryoprotectant agents (10% methanol, 10% DMSO, and 10% ethylene glycol) and two activator agents (0.29% NaCl and 1% NaHCO3). Glucose 5% extender was used as a diluent solution and sperm loaded in 0.25 straws was frozen in nitrogen vapor (dry shipper). Fresh spermatozoon was 25.46±2.54µm long, the head was spherical (1.51±0.18µm) with no acrosome, the midpiece was cone shaped (0.93±0.17µm) with presence of vesicles, slightly asymmetric, and the flagellum was single (21.48±2.45µm). Post-thawed semen presented higher values (P< 0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO. The duration of sperm motility was longer (P< 0,05) when triggered in 1% NaHCO3 (96-21 s). Leiarius marmoratus semen cryopreserved with DMSO and methanol, presented respectively 7.32±4.21% and 8.94±6.69% of motility. However, the results were not satisfactory to establish a protocol for the specie.(AU)

Efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Tris-citrato na congelação com etilenoglicol ou glicerol de espermatozoides epididimários de gato doméstico (Felis catus) / Effect of different osmolarities of Tris-citrate extender on freezing epididymal sperm from domestic cat (Felis catus)with ethyleneglycol or glycerol

Objetivou-se com o estudo investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Triscitrato em espermatozóides epididimários de gatos domésticos (Feliscatus) e a congelação com glicerol ou etilenoglicol. Foram realizados dois experimentos, com 10 gatos. No Experimento 1, avaliou-se a manutenção dos parâmetros espermáticos em diluidor tris-citrato com osmolaridades 275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm, nos tempos (T0= 0, T1= 30 e T2= 60 min). No Experimento 2 a congelação foi realizada utilizando as osmolaridades 325 e 375 do glicerol a 4% ou etilenoglicol a 3%, 6%. Dentre as osmolaridades, quanto à motilidade a 325 mOsm não diferiu estatisticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Portanto, o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos.(AU)

The aim of this study was to investigate the effect of different osmotic potentials of Tris-citrate extender in epididymal spermatozoa of domestic cats (Felis catus), frozen with glycerol or ethyleneglycol. Two experiments were carried out, with ten cats. In the first experiment, the influence of extender with the osmolarityof 275, 325, 375, 425, 475 and 525 mOsm on sperm parameters were evaluated. In the second experiment, slow freezing was performed using glycerol at 4% or ethyleneglycolat 3% and 6% added to extender with 325and 375 mOsm. Among the osmolarities, the motilityat 325 mOsm did not differ statistically with epididymal fluid (control) at all times evaluated and at 375 mOsmat T0 and T1, and both showed no statistical differences between each other and between the times in all sperm parameters. Glycerol 4% added to extender with 475 mOsm was superior, presenting motilityof 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, without statistical differences with cooling and in morphology, no statistical differences were found between the two osmolarities. Therefore, 325 and 375 mOsm Triscitrate between the osmolarities tested and after freezing with 375 mOsm and 4%, glycerol maintained the sperm parameters.(AU)

Efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Tris-citrato na congelação com etilenoglicol ou glicerol de espermatozoides epididimários de gato doméstico (Felis catus) / Effect of different osmolarities of Tris-citrate extender on freezing epididymal sperm from domestic cat (Felis catus)with ethyleneglycol or glycerol

Objetivou-se com o estudo investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Triscitrato em espermatozóides epididimários de gatos domésticos (Feliscatus) e a congelação com glicerol ou etilenoglicol. Foram realizados dois experimentos, com 10 gatos. No Experimento 1, avaliou-se a manutenção dos parâmetros espermáticos em diluidor tris-citrato com osmolaridades 275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm, nos tempos (T0= 0, T1= 30 e T2= 60 min). No Experimento 2 a congelação foi realizada utilizando as osmolaridades 325 e 375 do glicerol a 4% ou etilenoglicol a 3%, 6%. Dentre as osmolaridades, quanto à motilidade a 325 mOsm não diferiu estatisticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Portanto, o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos.

The aim of this study was to investigate the effect of different osmotic potentials of Tris-citrate extender in epididymal spermatozoa of domestic cats (Felis catus), frozen with glycerol or ethyleneglycol. Two experiments were carried out, with ten cats. In the first experiment, the influence of extender with the osmolarityof 275, 325, 375, 425, 475 and 525 mOsm on sperm parameters were evaluated. In the second experiment, slow freezing was performed using glycerol at 4% or ethyleneglycolat 3% and 6% added to extender with 325and 375 mOsm. Among the osmolarities, the motilityat 325 mOsm did not differ statistically with epididymal fluid (control) at all times evaluated and at 375 mOsmat T0 and T1, and both showed no statistical differences between each other and between the times in all sperm parameters. Glycerol 4% added to extender with 475 mOsm was superior, presenting motilityof 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, without statistical differences with cooling and in morphology, no statistical differences were found between the two osmolarities. Therefore, 325 and 375 mOsm Triscitrate between the osmolarities tested and after freezing with 375 mOsm and 4%, glycerol maintained the sperm parameters.

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Combination of ethylene glycol with sucrose increases survival rate after vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) / Combinação de etilenoglicol com sacarose aumenta a taxa de sobrevivência após a vitrificação de tecido somático de catetos (Pecari tajacu Linnaeus, 1758)

The cryopreservation of somatic tissue in collared peccaries promotes an alternative source of genetic material of this specie. The solid-surface vitrification (SSV) is a great option for tissue conservation; nevertheless, the optimization of SSV requirements is necessary, especially when referred to cryoprotectants that will compose the vitrification solution. Therefore, the aim was to evaluate the effect of the presence of 0.25 M sucrose in addition to different combinations (only or association) and concentrations (1.5 M or 3.0 M) of ethylene glycol (EG) and/or dimethyl sulfoxide (DMSO) in the somatic tissue vitrification of collared peccaries. Subsequently, we tested six combinations of cryoprotectants with or without sucrose in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) plus 10% fetal bovine serum (FBS). Thus, 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7%) and dermis (34.5 vs. 36.6%), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) ratio (0.09 vs. 0.17%) and nucleus area (15.4 vs. 14.5 µm2) respectively. In conclusion, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose and 10% FBS resulted in a better cryoprotectant composition in the SSV for somatic tissue of collared peccaries.(AU)

A criopreservação de tecido somático em catetos promove uma fonte alternativa de material genético nesta espécie. A vitrificação em superfície sólida (VSS) é uma ótima opção para a conservação do tecido; contudo, a otimização dos requerimentos da VSS é necessária, especialmente quanto aos crioprotetores que irão compor a solução de vitrificação. Portanto, o objetivo foi avaliar o efeito da presença de 0,25 M de sacarose em adição com diferentes combinações (individual ou associação) e concentrações (1,5 M ou 3,0 M) de etilenoglicol (EG) e/ou dimetilsulfóxido (DMSO) na vitrificação de tecido somático de catetos. Subsequentemente, nós testamos seis combinações de crioprotetores com ou sem sacarose em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Assim, 3,0 M de EG com sacarose foi capaz de manter as características normais do tecido comparado com o não vitrificado (controle), especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7%) e derme (34,5 vs. 36,6%), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0), razão da região argirófila organizadora de nucléolo (AgNOR) (0,09 vs. 0,17%) e área do núcleo (15,4vs.14,5 µm2), respectivamente. Em conclusão, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose e 10% de SFB resultaram na melhor composição de crioprotetores na VSS para tecido somático de catetos.(AU)

Combination of ethylene glycol with sucrose increases survival rate after vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) / Combinação de etilenoglicol com sacarose aumenta a taxa de sobrevivência após a vitrificação de tecido somático de catetos (Pecari tajacu Linnaeus, 1758)

The cryopreservation of somatic tissue in collared peccaries promotes an alternative source of genetic material of this specie. The solid-surface vitrification (SSV) is a great option for tissue conservation; nevertheless, the optimization of SSV requirements is necessary, especially when referred to cryoprotectants that will compose the vitrification solution. Therefore, the aim was to evaluate the effect of the presence of 0.25 M sucrose in addition to different combinations (only or association) and concentrations (1.5 M or 3.0 M) of ethylene glycol (EG) and/or dimethyl sulfoxide (DMSO) in the somatic tissue vitrification of collared peccaries. Subsequently, we tested six combinations of cryoprotectants with or without sucrose in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) plus 10% fetal bovine serum (FBS). Thus, 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7%) and dermis (34.5 vs. 36.6%), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) ratio (0.09 vs. 0.17%) and nucleus area (15.4 vs. 14.5 µm2) respectively. In conclusion, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose and 10% FBS resulted in a better cryoprotectant composition in the SSV for somatic tissue of collared peccaries.(AU)

A criopreservação de tecido somático em catetos promove uma fonte alternativa de material genético nesta espécie. A vitrificação em superfície sólida (VSS) é uma ótima opção para a conservação do tecido; contudo, a otimização dos requerimentos da VSS é necessária, especialmente quanto aos crioprotetores que irão compor a solução de vitrificação. Portanto, o objetivo foi avaliar o efeito da presença de 0,25 M de sacarose em adição com diferentes combinações (individual ou associação) e concentrações (1,5 M ou 3,0 M) de etilenoglicol (EG) e/ou dimetilsulfóxido (DMSO) na vitrificação de tecido somático de catetos. Subsequentemente, nós testamos seis combinações de crioprotetores com ou sem sacarose em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Assim, 3,0 M de EG com sacarose foi capaz de manter as características normais do tecido comparado com o não vitrificado (controle), especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7%) e derme (34,5 vs. 36,6%), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0), razão da região argirófila organizadora de nucléolo (AgNOR) (0,09 vs. 0,17%) e área do núcleo (15,4vs.14,5 µm2), respectivamente. Em conclusão, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose e 10% de SFB resultaram na melhor composição de crioprotetores na VSS para tecido somático de catetos.(AU)

Combination of ethylene glycol with sucrose increases survival rate after vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Pecari tajacu Linnaeus, 1758)

ABSTRACT: The cryopreservation of somatic tissue in collared peccaries promotes an alternative source of genetic material of this specie. The solid-surface vitrification (SSV) is a great option for tissue conservation; nevertheless, the optimization of SSV requirements is necessary, especially when referred to cryoprotectants that will compose the vitrification solution. Therefore, the aim was to evaluate the effect of the presence of 0.25 M sucrose in addition to different combinations (only or association) and concentrations (1.5 M or 3.0 M) of ethylene glycol (EG) and/or dimethyl sulfoxide (DMSO) in the somatic tissue vitrification of collared peccaries. Subsequently, we tested six combinations of cryoprotectants with or without sucrose in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) plus 10% fetal bovine serum (FBS). Thus, 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7%) and dermis (34.5 vs. 36.6%), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) ratio (0.09 vs. 0.17%) and nucleus area (15.4 vs. 14.5 m2) respectively. In conclusion, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose and 10% FBS resulted in a better cryoprotectant composition in the SSV for somatic tissue of collared peccaries.

RESUMO: A criopreservação de tecido somático em catetos promove uma fonte alternativa de material genético nesta espécie. A vitrificação em superfície sólida (VSS) é uma ótima opção para a conservação do tecido; contudo, a otimização dos requerimentos da VSS é necessária, especialmente quanto aos crioprotetores que irão compor a solução de vitrificação. Portanto, o objetivo foi avaliar o efeito da presença de 0,25 M de sacarose em adição com diferentes combinações (individual ou associação) e concentrações (1,5 M ou 3,0 M) de etilenoglicol (EG) e/ou dimetilsulfóxido (DMSO) na vitrificação de tecido somático de catetos. Subsequentemente, nós testamos seis combinações de crioprotetores com ou sem sacarose em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Assim, 3,0 M de EG com sacarose foi capaz de manter as características normais do tecido comparado com o não vitrificado (controle), especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7%) e derme (34,5 vs. 36,6%), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0), razão da região argirófila organizadora de nucléolo (AgNOR) (0,09 vs. 0,17%) e área do núcleo (15,4vs.14,5 m2), respectivamente. Em conclusão, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose e 10% de SFB resultaram na melhor composição de crioprotetores na VSS para tecido somático de catetos.

Surubim-do-Paraíba oocytes viability after being exposed to different cryoprotectants / Viabilidade de oócitos de surubim do Paraíba após exposição a diferentes crioprotetores

To know the non-toxic cryoprotectants to fish oocytes is of extreme importance for tests that aim to increase oocyte resistance to cold, thus allowing more advanced studies in cryopreservation. Therefore, commonly used cryoprotectants such as methanol, dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, propylene glycol, sucrose and fructose were studied. Immature oocytes from the initial to vitelogenic (diameter 1.7 mm) and mature (diameter >1.8 mm) stages of Steindachneridion parahybae were evaluated. Four distinct experiments were performed, three using immature oocytes and one using oocytes at the mature stage. For each oocyte stage, the best maintenance solution to be used: Hank or 50% L15 and; viability after baths for 30min (room temperature) at cryoprotectant concentrations ranging from 0.25 to 4M were evaluated. Different tests were used to evaluate oocyte viability: in vitro maturation followed by observation of germinal vesicle breakdown (only for immature oocytes), Trypan Blue staining (all stages) and fertilization and hatching rates (mature stage only). Results showed that the toxic effect of cryoprotectants on oocytes generally increases with increasing concentrations. Sensitivity of oocytes to cryoprotectants increases according to the stage of development, with mature oocytes being more sensitive. Sucrose, fructose, methanol, propylene glycol and dimethyl sulfoxide can be used as cryoprotectants for S. parahybae oocytes.(AU)

Conhecer os crioprotetores não tóxicos aos oócitos de peixes é de extrema importância para testes que visam aumentar a resistência dos oócitos ao frio, permitindo, assim, estudos mais avançados em criopreservação. Desta forma, crioprotetores comumente utilizados como o metanol, dimetil sulfóxido, etilenoglicol, propilenoglicol, sacarose e frutose foram estudados. Os oócitos imaturos, nos estágios inicial até vitelogênico (diâmetro 1,7mm), e maduros (diâmetro >1,8mm) de Steindachneridion parahybae foram avaliados. Quatro experimentos distintos foram realizados, sendo três destes utilizando oócitos imaturos, e um usando oócitos no estágio maduro. Para cada estágio oocitários foram avaliados, considerando qual a melhor solução de manutenção a ser utilizada: Hank ou 50% L15 e; viabilidade após banhos por 30min (temperatura ambiente) em concentrações de crioprotetores, variando de 0,25 a 4M. Diferentes testes foram utilizados para avaliar a viabilidade dos oócitos: maturação in vitro seguido por observação da quebra da vesícula germinativa (somente para oócitos imaturos), coloração por Azul de Tripan (todos os estágios) e taxas de fertilização e eclosão (somente no estágio maduro). Os resultados mostraram que o efeito tóxico dos crioprotetores em oócitos geralmente crescem com o aumento das concentrações. A sensibilidade dos oócitos a crioprotetores aumentam de acordo com o estágio de desenvolvimento, com oócitos maduros sendo mais sensíveis. Sacarose, frutose, metanol, propileno glicol e dimetil sulfóxido podem ser usados como crioprotetores para oócitos de S. parahybae.(AU)

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) / Effect of vitamins added to the ACP-104 extender on the quality of cryopreserved semen of common carp (Cyprinus carpio)

O objetivo da presente pesquisa foi alcançado com a divisão da pesquisa em dois experimentos: (1) aperfeiçoar o protocolo de congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a criopreservação seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) sobre os melhores diluidores testados no experimento 1 na qualidade do sêmen pós-descongelado da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools de sêmen, provenientes de 14 machos selecionados. As amostras seminais coletadas foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais e à vitalidade espermática antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO), ou etilenoglicol (EG), ou glicerol, ou metanol, todos à concentração de 10%, diluídos em 1:3 (sêmen:diluidor). As amostras foram, então, congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196°C). Para o experimento 2, foram formados oito pools provenientes da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais foram avaliadas seguindo as mesmas análises do experimento 1, acrescentando-se a duração da motilidade total. A criopreservação seminal utilizou-se do meio ACP-104 acrescido de DMSO ou EG, suplementado ou não com vitamina C ou E. Os melhores resultados encontrados no experimento 1 foram obtidos com o DMSO e o EG. Estes não diferiram significativamente entre si para a motilidade total (24% e 28%; P>0,05) e a normalidade espermática (32% e 26%; P>0,05), respectivamente. Para o experimento 2, o EG suplementado com vitamina E produziu significativamente resultados superiores de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E.(AU)

The objective was achieved by dividing the research into two experiments: (1) improving the freezing protocol using powdered coconut water (ACP-104) as a diluent for the cryopreservation seminal of common carp; (2) evaluating the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with the best extenders tested in experiment 1 on the quality of post-thawed. For experiment 1, semen pools from 14 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity, percentage of normal sperm and sperm vitality before and after the seminal cryopreservation. This was done in ACP-104 extender plus dimethyl sulfoxide (DMSO), or ethylene glycol (EG), or glycerol or methanol all at concentration 10% diluted in 1:3 (semen:extender). The samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shippers and stored in liquid nitrogen (-196 °C). For experiment 2, eight pools were formed from the 15 males. The semen samples were evaluated following the same analysis of experiment 1 adding duration of total motility. The sperm cryopreservation was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or EG supplemented or not with vitamin C or E. The best results found in Experiment 1 were obtained with DMSO and EG. They do not differ significantly for total motility (24% and 28%; P>0.05) and normal sperm (32% and 26%; P>0.05) respectively. For experiment 2, EG supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration of motility relative to DMSO. In conclusion, EG should be the cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E.(AU)

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) / Effect of vitamins added to the ACP-104 extender on the quality of cryopreserved semen of common carp (Cyprinus carpio)

O objetivo da presente pesquisa foi alcançado com a divisão da pesquisa em dois experimentos: (1) aperfeiçoar o protocolo de congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a criopreservação seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) sobre os melhores diluidores testados no experimento 1 na qualidade do sêmen pós-descongelado da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools de sêmen, provenientes de 14 machos selecionados. As amostras seminais coletadas foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais e à vitalidade espermática antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO), ou etilenoglicol (EG), ou glicerol, ou metanol, todos à concentração de 10%, diluídos em 1:3 (sêmen:diluidor). As amostras foram, então, congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196°C). Para o experimento 2, foram formados oito pools provenientes da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais foram avaliadas seguindo as mesmas análises do experimento 1, acrescentando-se a duração da motilidade total. A criopreservação seminal utilizou-se do meio ACP-104 acrescido de DMSO ou EG, suplementado ou não com vitamina C ou E. Os melhores resultados encontrados no experimento 1 foram obtidos com o DMSO e o EG. Estes não diferiram significativamente entre si para a motilidade total (24% e 28%; P>0,05) e a normalidade espermática (32% e 26%; P>0,05), respectivamente. Para o experimento 2, o EG suplementado com vitamina E produziu significativamente resultados superiores de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E.(AU)

The objective was achieved by dividing the research into two experiments: (1) improving the freezing protocol using powdered coconut water (ACP-104) as a diluent for the cryopreservation seminal of common carp; (2) evaluating the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with the best extenders tested in experiment 1 on the quality of post-thawed. For experiment 1, semen pools from 14 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity, percentage of normal sperm and sperm vitality before and after the seminal cryopreservation. This was done in ACP-104 extender plus dimethyl sulfoxide (DMSO), or ethylene glycol (EG), or glycerol or methanol all at concentration 10% diluted in 1:3 (semen:extender). The samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shippers and stored in liquid nitrogen (-196 °C). For experiment 2, eight pools were formed from the 15 males. The semen samples were evaluated following the same analysis of experiment 1 adding duration of total motility. The sperm cryopreservation was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or EG supplemented or not with vitamin C or E. The best results found in Experiment 1 were obtained with DMSO and EG. They do not differ significantly for total motility (24% and 28%; P>0.05) and normal sperm (32% and 26%; P>0.05) respectively. For experiment 2, EG supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration of motility relative to DMSO. In conclusion, EG should be the cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E.(AU)

AVALIAÇÃO TENSIOMÉTRICA E MICROBIOLÓGICA DO PERICÁRDIO BOVINO CONSERVADO EM DIFERENTES MEIOS

As membranas biológicas são tecidos compostos principalmente de colágeno e utilizadas de forma a servir de arcabouço em cirurgias reparadoras. Dentre os tecidos utilizados para essa finalidade, há o pericárdio, que é basicamente composto por tecido colágeno e uma fina camada de células epiteliais, suportando boa carga de tração em ensaios biomecânicos. O principal meio utilizado para conservação dessas membranas nas últimas décadas foi a glicerina 98%. Este trabalho objetivou analisar, primeiramente, se há diferenças na tração de acordo com o sentido da coleta em pericárdios bovinos, avaliar diferentes meios de conservação, por até 4 meses. Foi padronizado a abertura do pericárdio no sentido do maior eixo do coração (da base para o ápice), depois com a utilização de um molde realizado a coleta dos corpos de prova com 1 cm de largura e 4 cm de comprimento em sentido paralelo e perpendicular, ao corte de padronização. Foram utilizados 20 pericárdios provenientes de animais machos ou fêmeas, entre 18 e 32 meses, os pericárdios foram lavados em água corrente realizado a sua limpeza para retirada de gordura e os corpos de prova colocados para ensaio biomecânico de tração. Após a padronização do sentido de coleta perpendicular, foram colocados 14 pericárdios bovinos, utilizando o mesmo sentido de corte padronizado, colocados em caixas contendo os seguintes meios glicerina, propilenoglicol, etilenoglicol, butanol, álcool etílico e solução salina a 150%. Os meios foram avaliados mensalmente para cultura microbiológica e as membranas para ensaios biomecânicos de tração. Foi observado diferença significativa da força máxima de ruptura no sentido de coleta perpendicular ao maior eixo do coração, do que o sentido paralelo. Portanto foi padronizado o sentido de coleta perpendicular para as amostras que foram colocadas nos meios de conservação. Foi observado o aumento de força de ruptura significativamente das membranas conservadas no butanol nos períodos 30, 60 e 120 dias e no etilenoglicol com 30 dias. Já a força de deformação só não foi observada diferença estatística comparando o pericárdio fresco as membranas armazenadas no cloreto de sódio a 150%. Foi observado crescimento microbiológico somente no etilenoglicol e solução salina a 150% no momento 60 dias, nos outros meios não foi observado crescimento microbiológico. Todos os meios se demostraram viáveis para a conservação do pericárdio bovino, sendo que o butanol e o etilenoglicol proporcionaram maior resistência.

Biological membranes are tissues composed mainly of collagen and used in order to serve as a framework in reparative surgeries. Among the tissues used for this purpose, there is the pericardium, which is basically composed of collagen tissue and a thin layer of epithelial cells, supporting a good traction load in biomechanical tests. The main means used for the conservation of these membranes in the last decades was glycerin 98%. This work aimed to analyze, first, if there are differences in traction according to the direction of collection in bovine pericardiums, to evaluate different means of conservation, for up to 4 months. The opening of the pericardium in the direction of the largest axis of the heart (from the base to the apex) was standardized, then with the use of a mold, the specimens were collected 1 cm wide and 4 cm long in a parallel and perpendicular direction, to the standardization cut. Twenty pericardiums from male or female animals were used, between 18 and 32 months, the pericardiums were washed in running water, cleaned to remove fat and the specimens were placed for biomechanical traction testing. After standardizing the direction of perpendicular collection, 14 bovine pericardiums were placed, using the same standardized cutting direction, placed in boxes containing the following media: glycerin, propylene glycol, ethylene glycol, butanol, ethyl alcohol and saline solution 150%. The media were evaluated monthly for microbiological culture and the membranes for biomechanical tensile tests. There was a significant difference in the maximum rupture force in the direction of collection perpendicular to the largest axis of the heart, than in the parallel direction. Therefore, the direction of perpendicular collection was standardized for the samples that were placed in the conservation media. It was observed a significant increase in the breaking strength of the membranes conserved in butanol at periods 30, 60 and 120 days and in ethylene glycol at 30 days. However, the deformation force was not observed only when comparing the fresh pericardium with the membranes stored in sodium chloride 150%. Microbiological growth was observed only in ethylene glycol and saline solution 150% at the time of 60 days, in other media no microbiological growth was observed. All means proved to be viable for the conservation of bovine pericardium, but butanol and ethylene glycol provided greater resistance.

CONGELAÇÃO E VITRIFICAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMÁRIOS DE GATO DOMÉSTICO (FELIS CATUS): ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLOS PARA FELINOS SELVAGENS AMEAÇADOS DE EXTINÇÃO

Objetivou-se investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Tris-citrato acrescido de glicerol ou etilenoglicol na congelação de espermatozóides epididimários e realizar a vitrificação da cauda do epidídimo, para recuperação de espermatozoides viáveis de gatos domésticos (Felis catus). Dessa forma, o trabalho foi dividido em duas fases. Fase 1: Avaliar seis (275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm) diferentes osmolaridade do diluidor tris-citrato para a congelação de espermatozoides da cauda do epidídimo de gatos domésticos, utilizando glicerol ou etilenoglicol. Fase 2: Desenvolver um protocolo de vitrificação da cauda do epdidimo de gatos domésticos para a recuperação de espermatozoides viaiveis, utilizando glicerol e etilenoglicol a 40% associados a sacarose a 0,1M, utilizando a técnica de vitrificação SSV. Na Fase 1, dentre as osmolaridades, a motilidade da 325 mOsm não diferiu estatísticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Na Fase 2, o tratamento com etilenoglicol teve melhores resultados para todos os parâmetros de motilidade espermática (Motility, Vigor, CASA) comparados para glicerol (P 0,05). Não houve diferenças estatísticas na viabilidade e parâmetros de integridade do acrossoma (Trypan-Blue e Giemsa), membrana plasmática integridade (corantes fluorescentes Hoechst e PI) e na morfologia normal dos espermatozoides antes e depois da vitrificação entre os grupos experimentais. Os resultados do presente estudo mostraram que o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos, e foi obtido sucesso na vitrificação da cauda do epidídimo com etilenoglicol a 40% associado com sacarose (0,1 M), de espermatozoides epididimários de gatos domésticos.

The objective of this study was to investigate the effect of different osmolarities of the Triscitrate thinner plus glycerol or ethylene glycol on the freezing of epididymal sperm and to vitrify the tail of the epididymis, to recover viable sperm from domestic cats (Felis catus). Thus, the work was divided into two phases. Phase 1: Evaluate six (275, 325, 375, 425, 475 and 525mOsm) different osmolarity of the tris-citrate extender for freezing sperm from the tail of the epididymis of domestic cats, using glycerol or ethylene glycol. Phase 2: Develop a tail vitrification protocol for domestic cats epididymis for the recovery of viable sperm, using glycerol and 40% ethylene glycol associated with 0.1M sucrose, using the SSV vitrification technique. In Phase 1, among the osmolarities, the motility of 325 mOsm did not differ statistically with the epididymal fluid (control) at the three times and at 375 mOsm at T0 and T1, and both did not present statistical differences between themselves and between the times at all times. sperm parameters. The use of 4% glycerol in a diluter with 375 mOsm was superior, showing motility of 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, with no statistical differences with cooling and in the morphology no statistical differences were found between the two osmolarities. In Phase 2, Ethylene glycol treatment had better results for all sperm motility parameters (Motility, Vigor, CASA) compared to glycerol (P 0.05). There were no statistical differences in t viability and acrosome integrity (Trypan-Blue and Giemsa) parameters, plasma membrane integrity (fluorescent dyes Hoechst and PI) or overall health of morphologically normal sperm before and after vitrification among experimental groups. The results of the present study showed that Tris-citrate with 325 and 375 mOsm between the tested osmolarities and postfreeze with 375 mOsm and glycerol 4% maintained the sperm parameters, and was successful in vitrifying the tail of the epididymis with 40% ethylene glycol associated with sucrose (0.1 M), of epididymal sperm from domestic cats.

QUALIDADE DO SÊMEN CANINO SUBMETIDO A UM PROTOCOLO DE CONGELAMENTO RÁPIDO COM ADIÇÃO DE MELATONINA

Este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos da adição de melatonina, em diferentes concentrações, no congelamento de sêmen canino, com propósito de reduzir o estresse oxidativo devido ao processo de congelamento. Foram utilizados sêmen de seis cães machos, da raça Bulldog Francês, adultos, com idade entre dois e cinco anos, realizando-se três coletas de sêmen a cada 15 dias. O diluidor utilizado foi composto por Tris-gema e etilenoglicol 5%, e a melatonina foi acrescentada ao sêmen em cinco concentrações diferentes, sendo o grupo controle sem adição de melatonina (T0), e os demais grupos com adição de 1 mM (T1), 1,5 mM (T2), 2 mM (T3), 2,5 mM (T4) e 3 mM (T5). O sêmen foi submetido a refrigeração a 4ºC por 1h, foi mantido a 4cm do vapor de nitrogênio líquido por 10min e posteriormente imerso em nitrogênio líquido para criopreservação. O sêmen foi descongelado em banho-maria a 37ºC por 1 minuto e foram avaliados parâmetros cinéticos pelo software CASA-SCA, morfologia, integridade de membrana e marcadores do estresse oxidativo como catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e malondialdeído (MDA). Houve alta correlação (p<0,05) entre os parâmetros cinéticos do sêmen fresco (taxas de motilidade, velocidade curvilínea VCL, velocidade linear progressiva VSL, velocidade média da trajetória VAP e freqüência do batimento cruzado BCF). Não houve diferença significativa (p>0,05) nos parâmetros cinéticos, morfologia, integridade de membrana, níveis de MDA ou atividade enzimática antioxidante de CAT e SOD quando comparados os diferentes tratamentos instituídos com melatonina. Não houve correlação significativa (p>0,05) entre concentração espermática, proteína total, níveis de melatonina adicionada e variáveis relacionadas com qualidade do sêmen. Foi possível avaliar a eficácia do protocolo de congelamento e descongelamento para cães da raça Bulldog Francês, além de permitir uma avaliação completa do sêmen fresco no software CASA-SCA motility, definindo os padrões cinéticos dessa raça em específico. Conclui-se que a adição de melatonina no congelamento de sêmen canino não proporcionou melhoras significativas no estresse oxidativo e na qualidade do sêmen descongelado.

The aim of this study are evaluate the addition of melatonin, in different concentrations, in freezing canine semen. The purpose is reducing oxidative stress, due to cryopreservation process. Six males dogs, adults, with age of two to five years were used in the study, making three semen collection, every fifteen days. The extender used was composed by Tris-egg yolk and ethylene glycol 5%, and melatonin added in the semen in five different concentrations, being a control group without addition of melatonin (T0), and the others groups with 1 mM (T1), 1,5 mM (T2), 2 mM (T3), 2,5 mM (T4) e 3 mM (T5) of melatonin. The semen was refrigerated at 4ºC for 10 minutes, after positioned 4cm above the liquid nitrogen level, until it is plunged into liquid nitrogen for cryopreservation. The semen was thawed in water bath at 37ºC for one minute and evaluated for the kinetic parameters in software CASA-SCA, morphology, membrane integrity and parameters of oxidative stress, such as catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and malondialdehyde (MDA). A positive correlation were observed (p<0,05) between kinetic parameters of fresh semen (total and progressive motility, velocities curvilinear VCL; straight-line VSL; average path VAP and beat cross frequency BCF). There was no significant difference (p>0,05) in the kinetic parameters, morphology, membrane integrity, MDA or antioxidant ativity of CAT and SOD if the different treatments with melatonin are compared. There is no significant correlation (p>0,05) between sperm concentration, total protein, melatonin levels and variables related to semen quality. It was possible to evaluate the efficacy of the freezing and thawing protocol for frenchie bulldog canines, in addition to a thorough assessment about fresh semen in computer program CASA-SCA motility, defining kinetic patterns specifically for that breed. Melatonin addition in freezing canine semen didnt provide significant increases in pos-thawing quality semen and does not decrease oxidative stress.

VITRIFICAÇÃO ESPERMÁTICA DE Prochilodus brevis: DILUENTES, CRIOPROTETORES, VOLUME ARMAZENADO E SUPLEMENTAÇÃO COM POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA PELE DE Oreochromis niloticus

Prochilodus brevis é um importante peixe reofílico, cuja sobrevivência tem sido ameaçada por ações antrópicas, sendo necessário desenvolver biotecnologias para sua conservação, como a vitrificação seminal. Portanto, o estudo objetivou elaborar um protocolo de vitrificação para o sêmen de P. brevis, definindo o melhor diluente, a concentração de crioprotetor, o volume de armazenamento da amostra vitrificada e a suplementação do diluidor com polissacarídeos sulfatados (PS) extraídos da pele de O. niloticus. Foram realizados dois Experimentos de vitrificação seminal. O Experimento 1 foi dividido em duas etapas, que consistiram em avaliar dois crioprotetores (DMSO ou Etilenoglicol-EG) e sua associação (DMSO+EG) em diferentes concentrações (10%, 20% e 30%), bem como sua interação com dois diluentes [Glicose 5% - etapa 1; e Água de Coco em Pó (ACP-104) etapa 2]. No Experimento 2, avaliou-se a influência do diluente (Glicose 5% ou ACP-104), do volume armazenado (60 L e 420 L) e da suplementação do meio criodiluidor com 0,5 mg.mL-1 de PS. Em ambos os experimentos, o sêmen coletado foi diluído, vitrificado pelo método de gotas e armazenado em criotubos no nitrogênio líquido. Após 15 dias, as amostras foram descongeladas, centrifugadas, ressuspensas e avaliadas quanto à cinética, morfologia e integridade de membrana plasmática (IMP) e de DNA espermáticos (IDE). No Experimento 1, não houve interação (P>0,05) entre crioprotetores e suas concentrações para os parâmetros cinéticos e de morfologia. Contudo, ocorreu interação (P<0,05) para os demais parâmetros: a IMP foi superior quando se utilizou Glicose 5%+EG 10% e ACP-104+EG 30%; já a IDE foi superior com EG 30% para ambos os diluentes. No experimento 2, ACP-104 mostrou-se superior (P<0,05) à Glicose 5%. A suplementação com PS melhorou (P<0,05) as taxas de IMP e IDE, que foram superiores (P<0,05) quando a amostra foi armazenada em menor e em maior volume, respectivamente. Houve interação (P<0,05) entre diluente e volume armazenado, sendo ACP-104 superior à Glicose 5% para motilidade em ambos os volumes, e para Velocidade média do percurso (VAP) e IMP no volume maior. Glicose 5% teve VAP e integridade de membrana superiores quando armazenada em menor volume. Houve interação tripla (P<0,05) para IDE, que foi superior com ACP-104 e armazenado em maior volume, independente da suplementação. Conclui-se que ACP-104, associado a EG 30%, suplementado com 0,5 mg.mL-1 de PS e armazenado em maior volume compõem o melhor tratamento para a vitrificação espermática de P. brevis.

Prochilodus brevis is an important rheophilic fish, whose survival has been threatened by human actions, and it is necessary to develop biotechnologies for its conservation, such as sperm vitrification. Therefore, the study aimed to develop a vitrification protocol for P. brevis semen, defining the best diluent, cryoprotectant concentration, storage volume of the vitrified sample and supplementation of the thinner with sulfated polysaccharides (SP) extracted from the skin of O. niloticus. Two sperm vitrification experiments were carried out. Experiment 1 was divided into two steps, which consisted of evaluating two cryoprotectants (DMSO or Ethylene glycol-EG) and their association (DMSO+EG) at different concentrations (10%, 20% and 30%), as well as their interaction with two diluents [Glucose 5% - step 1; and Powder Coconut Water (ACP-104) - step 2]. In Experiment 2, the influence of the diluent (Glucose 5% and ACP-104), the stored volume (60 L and 420 L) and the supplementation of the cryodiluent medium with 0.5 mg.mL-1 of PS are evaluated. In both experiments, the collected semen was diluted, vitrified by the droplet method and stored in cryotubes in liquid nitrogen. After 15 days, the samples were thawed, centrifuged, resuspended and evaluated for kinetics, morphology and plasma membrane integrity (PMI) and spermatic DNA integrity (SDI). In experiment 1, there was no interaction (P>0.05) between cryoprotectants and their concentrations for kinetic and morphology parameters. However, interaction occurred (P<0.05) for the other parameters: PMI was higher when Glucose 5%+EG 10% and ACP-104+EG 30% were used; the SDI was higher with 30% EG for both diluents. In experiment 2, ACP-104 was higher (P<0.05) than Glucose 5%. SP supplementation improved (P<0.05) at PMI and SDI rates, which were higher (P<0.05) when the sample was stored lower and in higher volume, respectively. There was interaction (P<0.05) between diluent and stored volume, with ACP-104 higher than Glucose 5% for motility in both volumes, and for average path velocity (VAP) and PMI at higher volume. Glucose 5% had higher VAP and PMI when stored in lower volume. There was triple interaction (P<0.05) for SDI, which was higher with ACP-104 and stored in higher volume, regardless of supplementation. It was concluded that ACP-104, associated with 30% EG, supplemented with 0.5 mg. mL-1 SP and stored in larger volume make up the best treatment for the sperm vitrification of P. brevis.

INFLUÊNCIA DO PROTOCOLO DE VITRIFICAÇÃO NA SOBREVIVÊNCIA EMBRIONÁRIA E ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE BOAS PRÁTICAS DE MANEJO NA PRODUÇÃO DE BEZERROS ORIUNDOS DE GESTAÇÕES GEMELARES

Os objetivos do estudo foram: 1) Experimento 1-Avaliar o efeito de três diferentes soluções de vitrificação contendo etilenoglicol (EG) e dimetilsulfóxido (DMSO) em diferentes concentrações (10, 20 ou 25%) combinadas a glicose (1,0 M) ou a sacarose (1,0 M) sobre taxas de eclosão e expansão de embriões bovinos produzidos in vitro; 2) Experimento 2- Investigar os efeitos de diferentes soluções de vitrificação contendo a associação de EG (8; 12,5; 15 ou 25%) + DMSO (8; 12,5; 15 ou 25%) na ausência ou presença de propilenoglicol (8 ou 12,5%) e do tempo de exposição (1 minuto ou 20 segundos) sobre a reexpansão e taxas de eclosão de embriões Bos indicus vitrificados; 3) Experimento 3- Avaliar o efeito das boas práticas de manejo (indução do parto e monitoramento de mãe e crias no e após o nascimento) sobre a incidência de problemas reprodutivos (aborto, distocias, retenção de placenta e rejeição), número e sexo dos animais e casos de freemartinismo e taxa de mortalidade de bezerro produzidos por gestações gemelares. No experimento 1, a vitrificação diminuiu significativamente as taxas de reexpansão embrionária e de eclosão, independentemente da solução testada, quando comparada com embriões do grupo controle, mas as soluções com 25% EG e 25% DMSO resultaram em maiores taxas de reexpansão (75%) e eclosão (70 %). A adição de sacarose resultou em maiores taxas de embriões reexpandidos e eclodidos quando comparados com a adição de glicose. A principal conclusão do experimento 1 foi que a combinação de 25% EG + 25% DMSO e 1,0 M de sacarose permitiu a melhor eclosão e expansão de embriões bovinos aquecidos e vitrificados produzidos in vitro. Em relação ao experimento 2, os resultados mostraram que a vitrificação com 25% DMSO + 25% EG (exposição por 1 min e 20 s) resultou em maiores taxas de expansão (65,2%) e eclosão (68,2%). As menores taxas de reexpansão e eclosão foram observadas na vitrificação com 12,5% DMSO + 25% EG + 12,5% PG, com ambos os tempos de exposição testados (isto é, 3 minutos + 1 minuto e 1 minuto + 20 segundos). A principal conclusão do experimento 2 foi que a combinação de DMSO + EG foi eficaz na preservação de blastocistos, especialmente após um curto tempo de exposição. Finalmente, no experimento 3, vacas apresentando gestações gemelares sob boas práticas de manejo (fazenda A) apresentaram menores taxas de distocia (0%) e mortalidade de bezerros recém-nascidos (10%) quando comparadas às vacas da fazenda B com distocia (48%) e mortalidade de bezerros recém-nascidos (32%). Em conclusão, o uso de boas práticas de manejo (indução do parto e monitoramento de vacas e bezerros após o nascimento) aumentou a eficiência da produção de bezerros em vacas nelore.

The objectives of this study were: 1) Experiment 1- To evaluate the effects of bovine embryo vitrification by applying three different vitrification solutions containing ethylene glycol (EG) and dimethylsulphoxide (DMSO) at different concentrations (10, 20 or 25% each) combined with 1.0 M glucose or 1.0 M sucrose, on the in vitro hatching and expansion rates; 2) Experiment 2- To Assess the effects of the vitrification solution (ie, EG) + DMSO with or without propylene glycol (PG)) and of the exposure time on the re-expansion and hatching rates of vitrified Bos indicus embryos; 3) Experiment 3- To evalualate the effects of good management practices (labor induction and monitoring of cow and calves after birth) on the incidence of reproductive problems (abortion, dystocias, placenta retention and rejection) number and sex of animals and cases of freemartinism and calf mortality rate produced by twin pregnancies. In the experiment 1, vitrification significantly decreased embryonic re-expansion and hatching rates independently of the tested solution when compared with control embryos, but solutions with 25% EG 25% DMSO resulted in the highest re-expansion (75%) and hatching (70%) rates, independently of the added sugar. The addition of sucrose resulted in higher rates of re-expanded and hatched embryos when compared with glucose addition. The main conclusion of the experiment 1 was that the combination of 25% EG + 25% DMSO and 1.0 M sucrose allowed the best hatching and expansion of heated and vitrified bovine embryos produced in vitro. With regard to the experiment 2, the results showed that vitrification with 25% DMSO + 25% EG (exposure for 1 min and 20 s) resulted in the highest of expansion (65.2%) and hatching (68.2%) rates. The lowest re-expansion and hatching rates were observed in vitrification with 12.5% DMSO + 25% EG + 12.5% PG, with both tested exposure times (i.e, 3 min + 1 min and 1 min + 20 s). The main conclusion of the experiment 2 was that a combination of DMSO + EG was effective in preserving blastocysts, especially after a short exposure time. Finally, in the experiment 3, cows presenting twin pregnancies under good management practices (farm A) showed lower rates of dystocia (none) and new-born calf mortality (10%) when compared to farm B (48% dystocia and 32% new-born calf mortality). In conclusion, the use of good managements practices (labor induction and the monitoring of cow and calves after birth) increased cow-calf production efficiency in nelore cows.

ISOLAMENTO, CULTIVO E CRIOPRESERVAÇÃO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS DE CATETOS (PECARI TAJACU LINNAEUS, 1758)

A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais permite aumentar o potencial reprodutivo e garantir a conservação da biodiversidade. Neste sentido, objetivou-se estabelecer protocolos eficientes para o isolamento, cultivo e criopreservação de folículos pré-antrais de catetos. Em um primeiro experimento, ovários de seis fêmeas adultas foram destinados a diferentes métodos de isolamento folicular: enzimático utilizando a colagenase tipo IV, mecânico, utilizando lâmina de bisturi, e associação de ambos. Dentre estes, a maior quantidade (P < 0,05) de folículos foi obtido pelo método enzimático (961,7 ± 132,9), o qual também resultou na maior percentagem de folículos viáveis (98,7 ± 0,6%). Em adição, a integridade dos folículos obtidos pelo método enzimático foi confirmada pela microscopia eletrônica de varredura e por fluorescência (86%) após cultivo de 24 h. No segundo experimento, identificou-se a expressão dos receptores ALK-5 (tipo I) e BMPRII (tipo II) em fragmentos ovarianos de catetos por meio de PCR. Em seguida, procedeu-se o cultivo in vitro de tecido ovariano de seis animais por 1 ou 7 dias com Fator de Crescimento e Diferenciação 9 GDF-9 (0, 50, 100 ou 200 ng/mL). Verificou-se que os folículos cultivados por 7 dias com 200 ng/mL de GDF-9 mantiveram o diâmetro folicular e oocitário similar àqueles observados no dia 1. Em comparação com o controle fresco, a porcentagem de folículos em crescimento foi significativamente em todos os tratamentos, especialmente na concentração 200 ng/mL de GDF-9 por 7 dias. Ainda, a presença de GDF-9 a 200 ng/mL melhorou a proliferação celular após o cultivo. No experimento 3, o tecido ovariano foi vitrificado tanto em uperfície sólida como no sistema cryosystem com 3M etilenoglicol (EG), 3M dimetilsulfóxido (DMSO) ou 1,5 M EG associado a 1,5 M DMSO. Após vitrificação, constatou-se que todos os tratamentos mantiveram, de modo similar, a proporção de folículos viáveis e a ocorrência de proliferação celular. No entanto, todos os tratamentos mantiveram a proporção de PFs normais como o grupo controle (75,6 ± 8,6%), exceto (P <0,05) os vitrificados por SSV com EG (52,8 ± 5,9%) ou a combinação de CPAs (54,5 ± 10,4%). Finalmente, a partir da análise da expressão de caspase 3-ativada, apenas as amostras processadas por SSV com EG (43,4%) ou CPAs (33,4%), bem como aquelas vitrificadas em OTC com EG (46,7%), forneceram valores semelhantes aos encontrados para grupo controle fresco (36,7%). Diante destes resultados, sugere-se que o método enzimático é um procedimento eficiente para o isolamento de folículos pré-antrais de catetos; existe receptores BMPR2 e ALK-5 para o GDF-9 no cortex ovariano de cateto e que o GDF-9 na concentração de 200 ng / mL é importante para o desenvolvimento in vitro de folículos ovarianos dessa espécie. Ainda, a vitrificação usando o método OTC com etilenoglicol (3M) como crioprotetores é eficiente para preservação do tecido ovariano de catetos.

The manipulation of oocytes included in pre-antral ovarian follicles increases the reproductive potential and ensures the conservation of biodiversity. In this sense, the objective was to establish efficient protocols for the isolation, culture and cryopreservation of preantral follicles of peccary (Pecari tajacu). In a first experiment, ovaries of six adult females were assigned to different methods of follicular isolation: enzymatic using collagenase type IV, mechanical using a scalpel blade, and association of both. Among these, the highest amount (P <0.05) of follicles was provided by the enzymatic method (961.7 ± 132.9), which also provided the highest proportion of viable follicles (98.7 ± 0.6%). In addition, the integrity of the follicles obtained by the enzymatic method was confirmed by scanning electron microscopy and by fluorescence (86%) after 24h culture. In the second experiment, the expression of ALK-5 (type I) and BMPRII (type II) receptors was identified in ovarian fragments of hips by means of PCR. Then, in vitro culture of ovarian tissue of six animals for 1 or 7 days with GDF-9 (0, 50, 100 or 200 ng / ml) was performed. The follicles cultured for 7 days with 200 ng / mL of GDF-9 maintained the follicular and oocyte diameter similar to those observed on day 1. Compared to fresh control, the percentage of growing follicles was significantly increased in all the treatments, especially in 200 ng / ml GDF-9 for 7 days. In addition, the presence of 200 ng / ml GDF-9 improved cell proliferation after cultivation. In experiment 3, ovarian tissue was vitrified on solid surface and cryosystem systems with 3 M ethylene glycol (EG), 3 M dimethylsulfoxide (DMSO) or with 1.5 M EG plus 1.5 M DMSO. After vitrification, all treatments were found to have similarly maintained the proportion of viable follicles and the occurrence of cell proliferation. However, all treatments maintained the proportion of normal PFs as the control group (75.6 ± 8.6%), except (P <0.05) those vitrificated by SSV with EG (52.8 ± 5.9%) or the combination of CPAs (54.5 ± 10.4%). Finally, from the analysis of 3-activated caspase expression, only the samples processed by SSV with EG (43.4%) or CPAs (33.4%), as well as those glazed with OTC with EG (46.7%), provided values similar to those found for the fresh control group (36.7%). Considering these results, it is suggested that the enzymatic method is an efficient procedure for the isolation of preantral follicles of peccaries; there are BMPR2 and ALK-5 receptors for GDF-9 in the ovarian cortex and GDF-9 at a concentration of 200 ng / mL is important for the in vitro development of ovarian follicles of this species. Further, vitrification using the OTC method with ethylene glycol (3M) as cryoprotectants is efficient for preservation of ovarian tissue from peccaries.