Resumo
Bovine clinical mastitis caused by Staphylococcus spp. is a serious and widespread disease in the world of dairy farming. Antimicrobial therapy is of fundamental importance in the prevention and treatment of infectious mastitis, but the indiscriminate use of antimicrobials acts as a determining factor for the spread of the disease. The present study evaluated the resistance profiles of 57 Staphylococcus spp. isolated from bovine clinical mastitis to beta-lactams and gentamicin, relating characteristics of phenotype (in vitro susceptibility tests) and genotype (detection and expression of genes encoding resistance - mecA, mecALGA251, blaZ, femA, femB, and aacA-aphD - using PCR and RT-PCR, respectively). One or more genes coding for resistance to different antimicrobials were detected in 50 Staphylococcus spp. isolates. The femA and femB genes were the most frequent (75.4% for both). The observed expression of the genes was as follows: blaZ (60%), femA (39.5%), aacA-aphD (50%), femB (32.6%), mecA (8.3%), and mecALGA251 (0%). Considering the relevance of the genus Staphylococcus to bovine mastitis, this study aimed to elucidate aspects regarding the genotypic and phenotypic profiles of these microorganisms so as to contribute to the development of effective strategies for mastitis control.(AU)
A mastite clínica bovina causada por Staphylococcus spp. é uma doença grave e generalizada no mundo da pecuária leiteira. A terapia antimicrobiana é de fundamental importância na prevenção e no tratamento da mastite infecciosa, mas o uso indiscriminado de antimicrobianos atua como fator determinante para a disseminação da doença. O presente estudo avaliou os perfis de resistência de 57 Staphylococcus spp. isolados de mastite clínica bovina em relação ao uso de betalactâmicos e gentamicina, relacionando características do fenótipo (testes de suscetibilidade in vitro) e genótipo (detecção e expressão de genes que codificam resistência - mecA, mecALGA251, blaZ, femA, femB, e aacA-aphD - usando PCR e RT-PCR, respectivamente). Um ou mais genes que codificam resistência a diferentes antimicrobianos foram detectados em 50 Staphylococcus spp. isolados. Os genes femA e femB foram os mais frequentes (75,4% para ambos). A expressão observada dos genes foi a seguinte: blaZ (60%), femA (39,5%), aacA-aphD (50%), femB (32,6%), mecA (8,3%) e mecALGA251 (0%). Considerando-se a relevância do gênero Staphylococcus para a mastite bovina, este estudo teve como objetivo elucidar aspectos referentes aos perfis genotípico e fenotípico desses microrganismos, a fim de contribuir para o desenvolvimento de estratégias eficazes para o controle da mastite.(AU)
Assuntos
Staphylococcus/isolamento & purificação , Expressão Gênica/genética , Resistência beta-Lactâmica/genética , Farmacorresistência Bacteriana/genética , Mastite Bovina/microbiologia , Gentamicinas , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase ReversaResumo
A celulite canina juvenil é uma afecção rara, que acomete, em sua maioria, filhotes entre três semanas e seis meses de idade, cuja patogênese não está completamente elucidada; entretanto, pressupõe-se estar relacionada à falha imunológica e a reações à vacina polivalente, podendo ocorrer predisposição racial. Como manifestações clínicas, o cão apresenta pápulas, pústulas, alopecia, edema, eritema, crostas e cicatrizes, especialmente em pálpebras, lábios e focinhos, sendo também acometido o pavilhão auricular. Além dessas alterações dermatológicas, nota-se linfoadenomegalia regional. O diagnóstico se baseia em exclusão de dermatopatias que mimetizam o quadro clínico, e o tratamento precisa ser realizado de forma precoce e adequada, normalmente se utilizando doses altas de glicocorticoides. Quando iniciada a terapia precoce, o prognóstico é bom, embora as cicatrizes possam ser permanentes. No presente estudo, foi relatado um caso de filhote fêma mestiça de poodle, que começou a apresentar sinais de otite purulenta, lesões edemaciadas, crostosas e supurativas em região periocular, perilabial, mentoniana, pápulas e pústula em pavilhão auricular, linfoadenomegalia de linfonodos submandibulares e poplíteos, sendo que os sintomas começaram após aplicação da vacina polivalente canina. Foi iniciado tratamento à base de glicocorticoide e, devido à resposta rápida à terapia, foi iniciado desmame da medicação, quando a paciente teve quadro de recidiva, que se resolveu após reajustes terapêuticos.
Canine juvenile cellulitis is a rare condition that affects, in its majority, puppies between three weeks and six months of age, whose pathogenesis has not been completely elucidated; however, it is assumed to be related to immunological failure and reactions to the polyvalent vaccine, which may lead to racial predisposition. As clinical manifestations, the dog presents papules, pustules, alopecia, edema, erythema, crusts and scars, especially on the eyelids, lips and snouts, and the ear pinna is also affected. In addition to these dermatological changes, regional lymphadenomegaly is noted. Diagnosis is based on the exclusion of dermatopathies that mimic the clinical picture, and treatment needs to be carried out early and properly, usually using high doses of glucocorticoids. When therapy is started early, the prognosis is good, although scarring may be permanent. In the present study, a case of a crossbred female poodle pup was reported, which began to show signs of purulent otitis, swollen, crusty and suppurative lesions in the periocular, perilabial, mental region, papules and pustules in the pinna, lymphadenomegaly of submandibular lymph nodes and poplites, and the symptoms started after application of the polyvalent canine vaccine. Glucocorticoid-based treatment was started and, due to the rapid response to therapy, weaning from the medication was started, when the patient had a relapse, which resolved after therapeutic adjustments
Assuntos
Animais , Cães , Celulite/diagnóstico , Cães , Dermatologia , VacinasResumo
A celulite canina juvenil é uma afecção rara, que acomete, em sua maioria, filhotes entre três semanas e seis meses de idade, cuja patogênese não está completamente elucidada; entretanto, pressupõe-se estar relacionada à falha imunológica e a reações à vacina polivalente, podendo ocorrer predisposição racial. Como manifestações clínicas, o cão apresenta pápulas, pústulas, alopecia, edema, eritema, crostas e cicatrizes, especialmente em pálpebras, lábios e focinhos, sendo também acometido o pavilhão auricular. Além dessas alterações dermatológicas, nota-se linfoadenomegalia regional. O diagnóstico se baseia em exclusão de dermatopatias que mimetizam o quadro clínico, e o tratamento precisa ser realizado de forma precoce e adequada, normalmente se utilizando doses altas de glicocorticoides. Quando iniciada a terapia precoce, o prognóstico é bom, embora as cicatrizes possam ser permanentes. No presente estudo, foi relatado um caso de filhote fêma mestiça de poodle, que começou a apresentar sinais de otite purulenta, lesões edemaciadas, crostosas e supurativas em região periocular, perilabial, mentoniana, pápulas e pústula em pavilhão auricular, linfoadenomegalia de linfonodos submandibulares e poplíteos, sendo que os sintomas começaram após aplicação da vacina polivalente canina. Foi iniciado tratamento à base de glicocorticoide e, devido à resposta rápida à terapia, foi iniciado desmame da medicação, quando a paciente teve quadro de recidiva, que se resolveu após reajustes terapêuticos.(AU)
Canine juvenile cellulitis is a rare condition that affects, in its majority, puppies between three weeks and six months of age, whose pathogenesis has not been completely elucidated; however, it is assumed to be related to immunological failure and reactions to the polyvalent vaccine, which may lead to racial predisposition. As clinical manifestations, the dog presents papules, pustules, alopecia, edema, erythema, crusts and scars, especially on the eyelids, lips and snouts, and the ear pinna is also affected. In addition to these dermatological changes, regional lymphadenomegaly is noted. Diagnosis is based on the exclusion of dermatopathies that mimic the clinical picture, and treatment needs to be carried out early and properly, usually using high doses of glucocorticoids. When therapy is started early, the prognosis is good, although scarring may be permanent. In the present study, a case of a crossbred female poodle pup was reported, which began to show signs of purulent otitis, swollen, crusty and suppurative lesions in the periocular, perilabial, mental region, papules and pustules in the pinna, lymphadenomegaly of submandibular lymph nodes and poplites, and the symptoms started after application of the polyvalent canine vaccine. Glucocorticoid-based treatment was started and, due to the rapid response to therapy, weaning from the medication was started, when the patient had a relapse, which resolved after therapeutic adjustments(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Cães , Celulite/diagnóstico , Dermatologia , VacinasResumo
Os produtos cárneos prontos para consumo são bastante consumidos pela população brasileira, com isso pode representar um risco para a saúde dos consumidores caso microrganismos patogênicos estejam presentes, geralmente em virtude de más condições de higiene durante o processamento e manipulação destes produtos. Além disso, estes alimentos podem funcionar como disseminadores de microrganismos com resistência antimicrobiana. Dessa forma, buscou-se analisar a qualidade microbiológica de produtos cárneos (salsicha e mortadela) no varejo, determinar a resistência antimicrobiana fenotípica e genotípica dos isolados, e investigar a presença de genes de enterotoxinas. Para isso, esta tese foi composta por três capítulos. No Capítulo I foi realizada metanálise de dados da literatura com o objetivo de estimar a prevalência de Listeria monocytogenes em uma variedade de produtos cárneos brasileiros. Um total de 29 publicações de cinco bancos de dados, publicados entre 2009 e 2019, foram incluídos no estudo. A prevalência combinada de L. monocytogenes em produtos cárneos no Brasil foi elevada, com uma maior prevalência para carnes cruas e suínas, e pertencentes ao comércio e região Sudeste. No Capítulo II, objetivou-se apresentar os resultados da qualidade microbiológica de produtos cárneos vendidos em supermercados e minimercados localizados nas cidades de Patos, Sousa, Princesa Isabel e Itaporanga, PB, Brasil. Um total de 60 amostras (30 salsichas e 30 mortadelas) foram coletadas e submetidas a avaliação de coliformes totais e termotolerantes, estafilococos coagulase positiva (CoPS), Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e Clostridium perfringens. Além disso, as colônias isoladas foram submetidas à identificação por MALDI-TOF MS. A contagem média de coliformes totais e termotolerantes foi de 1,9 ± 1,5 e 1,6 ± 1,5 log NMP/g, respectivamente. E. coli foi detectada em 6 (10%) amostras. Todas as amostras foram negativas para estafilococos coagulase positiva, Salmonella, Listeria e C. perfringens. Os gêneros mais frequentes identificados no MALDI-TOF foram Klebsiella, Enterobacter e Staphyloccoccus coagulase negativa. No Capítulo III, procurou-se determinar a ocorrência de resistência antimicrobiana e genes codificadores de enterotoxinas em Staphylococcus spp. isolados de produtos cárneos (mortadela e salsicha) comercializados no Sertão da Paraíba, Brasil. Foram isoladas 15 cepas de Staphylococcus coagulase negativa (CoNS) classificados como S. saprophyticus (n = 8), S. warneri (n = 2), S. hominis (n = 2), S. epidermidis (n = 1), S. pausteri (n = 1) e S. capitis (n = 1) por MALDI TOF MS. Os isolados foram testados quanto à resistência a ampicilina, amoxicilina/ác. clavulânico, ceftazidima, gentamicina, cloranfenicol, norfloxacina, meropenem, oxacilina, tetraciclina e vancomicina pelo método de disco difusão. A presença dos genes de resistência mecA, blaZ, femA e icaD e de enterotoxinas clássicas sea, seb, sec, sed e see foi analisada por PCR. Foi observada a ocorrência de resistência antimicrobiana nos isolados CoNS, principalmente S. saprophyticus, com altas taxas de resistência contra ampicilina e oxacilina; foram detectados altos índices de isolados com a presença de mecA, blaZ e femA; e foi verificada a presença de genes de enterotoxinas clássicas sea e sec nos isolados.
Ready-to-eat meat products are widely consumed by the Brazilian population, which may represent a risk to consumers' health if pathogenic microorganisms are present, usually due to poor hygiene conditions during the processing and handling of these products. In addition, these foods can act as disseminators of microorganisms with antimicrobial resistance. Thus, we sought to analyze the microbiological quality of meat products (sausage and mortadella) in retail, determine the phenotypic and genotypic antimicrobial resistance of the isolates, and investigate the presence of enterotoxin genes. For this, this thesis was composed of three chapters. In Chapter I, a meta-analysis of literature data was carried out in order to estimate the prevalence of L. monocytogenes in a variety of Brazilian meat products. A total of 29 publications from five databases, published between 2009 and 2019, were included in the study. The combined prevalence of Listeria monocytogenes in meat products in Brazil was high, with a higher prevalence for raw and pork meat, and belonging to the market and the Southeast region. In Chapter II, the objective was to present the results of the microbiological quality of meat products sold in supermarkets and mini-markets located in the cities of Patos, Sousa, Princesa Isabel and Itaporanga, PB, Brazil. A total of 60 samples (30 sausages and 30 mortadellas) were collected and subjected to evaluation of total and thermotolerant coliforms, coagulase positive staphylococci (CoPS), Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens. In addition, isolated colonies were subjected to identification by MALDI-TOF MS. The average count of total and thermotolerant coliforms was 1.9±1.5 and 1.6±1.5 log MPN/g, respectively. E. coli was detected in 6 (10%) samples. All samples were negative for coagulase positive staphylococci, Salmonella, Listeria and C. perfringens. The most frequent genera identified in the MALDI-TOF were Klebsiella, Enterobacter and Staphyloccoccus coagulase negative. In Chapter III, we sought to determine the occurrence of antimicrobial resistance and genes encoding enterotoxins in Staphylococcus spp. isolated from meat products (mortadella and sausage) marketed in the Sertão da Paraíba, Brazil. Fifteen strains of coagulase negative Staphylococcus (CoNS) were classified as S. saprophyticus (n = 8), S. warneri (n = 2), S. hominis (n = 2), S. epidermidis (n = 1), S pausteri (n = 1) and S. capitis (n = 1) by MALDI TOF MS. The isolates were tested for resistance to ampicillin, amoxicillin/acid. clavulanic, ceftazidime, gentamicin, chloramphenicol, norfloxacin, meropenem, oxacillin, tetracycline and vancomycin by the disc diffusion method. The presence of the mecA, blaZ, femA and icaD resistance genes and classic sea, seb, sec, sed and see enterotoxins was analyzed by PCR. The occurrence of antimicrobial resistance was observed in CoNS isolates, mainly S. saprophyticus, with high rates of resistance against ampicillin and oxacillin; high levels of isolates were detected with the presence of mecA, blaZ and femA; and the presence of classical enterotoxin genes sea and sec was verified in the isolates.
Resumo
This study identified Staphylococcus aureus and the methicillin-resistant (MRSA) strains in raw milk samples using molecular methods, and their minimum inhibitory concentrations (MIC) were evaluated. Two hundred fifty-one samples of raw milk samples from bulk tanks, collected in the state of Minas Gerais, Brazil were analyzed using polymerase chain reaction (PCR) to investigate the presence of femA gene in 278 S.aureus isolates. Furthermore, MRSA strains were investigated for detecting mecA gene. All of 278 isolates contained the femA gene (132 bp), and in 11 samples (3.95 %) the mecA gene (533 bp) was identified. The minimum inhibitory concentration against S. aureus was determined using enrofloxacin, trimethoprim-sulfamethoxazole, gentamicin, azithromycin, tetracycline, cephalothin, amoxicillin, penicillin G and lincomycin. Enrofloxacin and trimethoprim-sulfamethoxazole showed to be the most effective inhibitors, as this study identified 149 of 161 isolates (92.5 % of susceptibility) with MIC≤ 4 mg/ mL, and 55 of 66 isolates (83.3 % of susceptibility) with MIC≤ 2 mg/mL, for the first antimicrobial drug and the second one, respectively.(AU)
O objetivo deste trabalho foi de identificar Staphylococcus aureus e as linhagens resistentes à meticilina (MRSA) em amostras de leite cru bovino, por meio de métodos moleculares, e de determinar a concentração inibitória mínima (CIM) dos isolados. S. aureus pode apresentar linhagens resistentes à meticilina e a outros antimicrobianos utilizados na prática médico-veterinária. Foram analisadas 251 amostras de leite cru de tanques de expansão, procedentes de cinco mesorregiões produtoras de leite de Minas Gerais Brasil. Por meio de PCR foi identificada a presença do gene femA em 278 isolados de S. aureus; e as linhagens MRSA foram determinadas pela presença do gene mecA. Os ensaios de PCR foram positivos para gene femA em 100 % dos isolados testados; e entre essas amostras 11 (3,95 %) apresentaram produto amplificado de 533 pb correspondente ao gene mecA. Para analisar a susceptibilidade dos isolados foi realizado o teste de CIM para nove substâncias antimicrobianas. Foram identificados 149 isolados de S. aureus que apresentaram CIM≤ 4 µg/mL para enrofloxacina, com 92,54 % de susceptibilidade, e 55 isolados testados para sulfametoxazol+trimetoprima, apresentaram CIM ≤ 2 µg/mL com 83,33 % de susceptibilidade. Estes antimicrobianos foram considerados os mais eficazes.(AU)
Assuntos
Testes de Sensibilidade Microbiana , Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina , Leite/microbiologiaResumo
A produção leiteira no Brasil se destaca por ser uma das atividades mais importantes para pecuária brasileira, sendo responsável pela fonte de renda de milhões de brasileiros. Entretanto, essa atividade é constantemente influenciada pela ocorrência da mastite, principalmente na forma subclínica, que ocorre nos rebanhos. Staphylococcus spp constitui o principal gênero de bactérias causadoras de mastite em bovinos. Objetivou-se com este estudo pesquisar Staphylococcus aureus enterotoxigênicos formadores de biofilmes isolados de bovinos com mastite em rebanhos leiteiros e traçar o perfil de resistência frente à desinfetantes. Foram selecionadas 10 fazendas vinculadas à uma Usina de beneficiamento de leite sob registro federal. Foi realizado o exame físico da glândula mamária e do leite dos animais e, em seguida, realizado o California Mastitis Test. Foram coletadas amostras de 960 animais para o exame microbiológico após antissepsia do óstio dos tetos com álcool 70°GL. No laboratório, alíquotas de 10 µL de leite foram semeadas em ágar sangue ovino a 5% e, em seguida, as placas incubadas a 37°C por 48 horas. Posteriormente, 213 isolados Staphylococcus spp. classificados como fortes e moderados produtores de biofilmes foram selecionados para caracterização quanto ao perfil fenotípico e presença do gene femA para identificação de S. aureus. Destes, foram confirmados 152 isolados, que foram submetidos a detecção de genes capazes de produzir biofilmes (icaA, icaD e Bap), genes que codificam as enterotoxinas (SeA, SeB, SeC, SeD, SeE), e genes relacionados a resistência (Tet(k), Vana). Testou-se a ação de desinfetantes (clorexidine e ácido láctico) utilizados na rotina de ordenha sobre o biofilme em formação e consolidado em 86 destas amostras. Em 84,16% (134/152) das amostras foram constatados o gene BAP, em 78,29% (119/152) o gene IcaD e, em apenas 1,32% (2/152) o gene IcaA. Apenas as enterotoxinas Sec em 17,76% (27/152) das amostras e See em 0,66% (1/152). Foram encontrados genes de resistência TetK em 48,68% (74/152) das amostras. Observou-se resultado satisfatório dos dois desinfetantes testados sobre o biofilme em formação, em 94,2% (81/86) dos isolados submetidos ao clorexidine e 100% dos submetidos ao ácido láctico. Entretanto, para o biofilme consolidado o percentual de ação foi bem inferior, o ácido láctico apresentou baixa eficácia sobre o biofilme já formado, com apenas 3,5% da taxa de redução, enquanto a clorexidine conseguiu reduzir 43% do biofilme consolidado. O efeito dos desinfetantes na redução da adesão de biofilmes foi bastante significativo. Sugere-se a investigação de produtos mais eficazes, que atuem tanto nas células bacterianas livres, como nos microrganismos na forma de biofilmes.
Dairy production in Brazil stands out as one of the most important activities for Brazilian livestock, being responsible for the source of income of millions of Brazilians. However, this activity is constantly influenced by the occurrence of mastitis, especially in the subclinical form, which occurs in herds. Staphylococcus spp is the main genus of mastitis-causing bacteria in cattle. The aim of this study was to investigate enterotoxigenic Staphylococcus aureus biofilm-forming isolates from bovine mastitis in dairy herds and to profile resistance against disinfectants. Ten farms linked to a federally registered Milk Processing power plant were selected. Physical examination of the mammary gland and milk of the animals was performed and then the California Mastitis Test. Samples were collected from 960 animals for microbiological examination after antisepsis of the roof ostium with 70 ° GL alcohol. In the laboratory, aliquots of 10 µl of milk were seeded on 5% sheep blood agar and then plates incubated at 37 ° C for 48 hours. Subsequently, 213 isolates Staphylococcus spp. classified as strong and moderate biofilm producers were selected for characterization regarding the phenotypic profile and presence of the femA gene for identification of S. aureus. Of these, 152 isolates were confirmed, which were subjected to detection of genes capable of producing biofilms (icaA, icaD and Bap), genes encoding enterotoxins (SeA, SeB, SeC, SeD, SeE), and resistance related genes (Tet (k), Vana). The action of disinfectants (chlorhexidine and lactic acid) used in the milking routine on biofilm in formation and consolidated in 86 of these samples was tested. In 84.16% (134/152) of the samples the BAP gene was found, in 78.29% (119/152) the IcaD gene and in only 1.32% (2/152) the IcaA gene. Only enterotoxins Sec in 17.76% (27/152) of the samples and See in 0.66% (1/152). TetK resistance genes were found in 48.68% (74/152) of the samples. Satisfactory results were observed for the two disinfectants tested on the biofilm in formation, in 94.2% (81/86) of chlorhexidine isolates and 100% of lactic acid isolates. However, for the consolidated biofilm the action percentage was much lower, the lactic acid showed low efficacy over the already formed biofilm, with only 3.5% of reduction rate, while chlorhexidine was able to reduce 43% of the consolidated biofilm. The effect of disinfectants on reducing biofilm adhesion was quite significant. Research into more effective products that act on both free bacterial cells and microorganisms in the form of biofilms is suggested.
Resumo
A carne suína é a mais consumida no mundo e uma importante fonte de proteína. Neste cenário o Brasil é o quarto produtor mundial e o Paraná está como terceiro produtor nacional. O sistema de confinamento é o principal meio de criação na região Sul, que é dividido em unidade produtora de leitões e de terminação, sendo responsável por suprir grande parte da demanda de carne. Este modelo é um importante meio de disseminação de patógenos. Entre os diversos patógenos, está Staphylococcus aureus, que é responsável por diversos problemas clínicos na suinocultura e em humanos. Este micro-organismo possui natureza ubíqua sendo considerado um indicador de higiene na indústria de alimentos. O S. aureus pode causar doenças transmitida por alimentos (DTA), pela produção de enterotoxinas. Atualmente cepas resistentes à meticilina (MRSA) e vancomicina (VRSA), responsáveis por casos de infecções nosocomiais são as mais estudadas já que o MRSA está disseminado em ambientes extra hospitalares e tem sido isolado de vários animais domésticos, inclusive suínos. Deste modo, o objetivo do presente projeto foi rastrear a contaminação de S. aureus resistente a diferentes antimicrobianos na cadeia produtora de suínos. Foram identificados possíveis focos de contaminação durante o processo. O estudo foi conduzido em granjas de terminação de suínos e em abatedouro localizados no extremo oeste do Paraná. Com os resultados, obtivemos dados da contaminação nas etapas de produção, bem como identificação da disseminação de cepas de MRSA e o perfil de resistência para antimicrobianos da região estudada. Dez granjas de criação de suínos (terminação) e um frigorífico foram selecionados para coleta de 540 amostras ao longo da cadeia produtiva de carne suína, que foram submetidas a enumeração de SCP e S. aureus, e posterior isolamento e identificação molecular de S. aureus. A contaminação por Staphylococcus aureus foi dentro do limite aceitável (<2 log UFC/cm²) em 530 (98,1%) amostras, entre 2 e 3 logs UFC/cm² em 2 (0,4%) amostras, entre 3 e 4 logs UFC/cm², em 1 (0,2%) amostras e superior a 5 logs UFC/cm² 7 (1,3%) das amostras. Contagens superiores a 4 log UFC/cm² foram observadas em baias de terminação e pocilgas de espera. A enumeração de SCP foi possível em 20 (25%) isolados, sendo três (%) referente ao piso da baia na granja, 10 (1,8%) foi obtida da pocilga de espera no abatedouro e sete (1,3%) das amostras de carcaça após a sangria. Considerando as diferentes etapas de processamento, não foram observadas isolados SCP entre as demais amostras obtidas no ambiente de processamento e nos produtos finais. Um total de 20 isolados de SCP foram selecionados e caracterizados quanto ao perfil bioquímico, porem apenas 18 confirmaram a presença do gene femA para identificação de S. aureus. Assim, 18 isolados de S. aureus foram submetidos a caracterização de seus perfis de resistência em relação a 10 antimicrobianos, por testes de susceptibilidade e pela pesquisa de genes relacionados a resistência. Considerando os resultados fenotípicos, 100% dos isolados de S. aureus apresentaram resistência a sulfamethoxazole (SUL), a penicilina (PEN), a eritromicina (ERI) e a tetraciclina (TET); 94,40% a ciprofloxacina (CIP) e ao cloranfenicol (CLO); 88,8% a gentamicina e 16,6% a oxacilina (OXA), todos apresentaram sensibilidade a rifampicina (RIF) à vancomicina (VAN). Os 18 isolados foram resistentes a todos os antimicrobianos testados, sendo que três dos isolados (pocilga e carcaça) a oito antimicrobianos, 13 (baias, pocilgas e carcaças) apresentaram resistência a sete antibióticos, um referente a pocilga de espera foi resistente seis antimicrobianos e um isolado da carcaça foi a quatro antimicrobianos; o perfil de resistência a PEN-GEN-ERI-TET-CIP-SUL-C foi o que apresentou maior frequência entre os isolados de S. aureus (n = 13). Em relação aos genes relacionados a resistência a diferentes antimicrobianos, 100% dos isolados de S. aureus apresentaram resultados positivos para blaZ (PEN), 22,2% para femB (OXA); para gene mecA (OXA) 50% dos isolados; não foram observados resultados positivos para tetK (TET), vanA (VAN) e mecC (OXA). Entre os isolados de S. aureus, três não apresentaram nenhum dos genes pesquisados, quatro apresentaram apenas um dos genes isolados (blaZ, femB e mecA), cinco apresentaram simultaneamente os genes mecA-blaZ, cinco somente para o gene blaZ, e um os genes femB-blaZ. Os resultados obtidos demonstram a presença de SCP e S. aureus apenas nas etapas iniciais de produção, importante por se tratar de um indicador de manipulação e higiene dentro da cadeia produtiva de carne suína. Também verificamos a presença de cepas com multirresistência e heterorresistencia aos diferentes antimicrobianos testados, bem como a confirmação e cepas MRSA dentro dos isolados além da presença de heterorresistencia entre os isolados, mostrando a importância do monitoramento microbiológico por metodologias fenotípicas e moleculares.
Pork is the most consumed in the world and an important source of protein. In This scenario, Brazil is the fourth World producer and Paraná is the third national producer. The confinement system is the main means of creation in the southern region, which is divided into piglets and finishing units, being responsible for supplying much of the meat demand. This model is an important means of dissemination of pathogens. Among the various pathogens, Staphylococcus aureus is responsible for several clinical problems in swine farming and humans. This microorganism has a ubiquitous nature being considered an indicator of hygiene in the food industry. S. aureus can cause food-borne diseases (DTA) by the production of enterotoxins. Currently, Methicillin-resistant (MRSA) and vancomycin (VRSA) strains, responsible for nosocomial infections are the most studied, since MRSA is disseminated in extra-hospital environments and has been isolated from several domestic animals, including Pigs. Thus, the objective of this project was to trace the contamination of S. aureus resistant to different antimicrobians in the pig-producing chain. Possible outbreaks of contamination Were identified during the process. The study was conducted in pig and slaughterhouse finishing farms located in the extreme west of Paraná. With the results, we obtained data from contamination in the stages of production, as well as identification of the dissemination of MRSA strains and the resistance profile for antimicrobians. Ten Pig Breeding Farms (finishing) and one refrigerator were selected to collect 540 samples along the pork production chain, which were subjected to the enumeration of SCP and S. aureus, and posterior isolation and molecular identification of S. Aureus. Contamination by Staphylococcus aureus was within the acceptable limit (< 2 log UFC/cm²) in 530 (98.1%) samples, between 2 and 3 logs UFC/cm² in 2 (0.4%) samples, between 3 and 4 UFC/cm² logs, in 1 (0.2%) samples and more than 5 logs UFC/cm² 7 (1.3%) of the samples. Counts greater than 4 log UFC/cm² were observed in finishing bays and waiting pig stable equipment. The SCP enumeration was possible in 20 (25%) isolated, three (%) regarding the floor of the bay in the farm, 10 (1.8, 1%) was obtained from the waiting pigsty in the slaughterhouse and seven (1.3%) of the carcass samples after sangria. Considering the different processing stages, no SCP isolates were observed between the other samples obtained in the processing environment and in the final products. A total of 20 SCP isolates were selected and characterized as to the biochemical profile, but only 18 confirmed the presence of the femA gene for identification of S. aureus. Thus, 18 isolates of S. aureus were subjected to characterization of their resistance profiles in relation to 10 antimicrobians, by susceptibility tests and by the research of genes related to resistance. Considering the phenotypic results, 100% of the S. aureus isolates showed resistance to sulfamethoxazole (SUL), penicillin (PEN), erythromycin (ERI) and tetracycline (TET); 94.40% ciprofloxacin (CIP) and chloramphenicol (CLO); 88.8% to gentamicin and 16.6% to oxacillin (OXA), all presented sensitivity to rifampicin (RIF) to vancomycin (VAN). The 18 isolates were resistant to all antimicrobials tested, and three of the isolates (pigsty and carcass) to eight antimicrobials, 13 (bays, pig stable equipment and carcasses) showed resistance to seven antibiotics, one referring to the waiting pigsty was resistant six antimicrobians and one isolate of the carcass was to four antimicrobians; The resistance profile to PEN-GEN-ERI-TET-CIP-SUL-C was the one that presented the highest frequency among S. aureus isolates (n = 13). In relation to the genes related to resistance to different antimicrobians, 100% of the isolates of S. aureus presented positive results for blaZ (PEN), 22.2% for femB (OXA); For mecA gene (OXA) 50% of the isolates; No positive results were observed for tetK (TET), vanA (VAN) and mecC (OXA). Among the isolates of S. aureus, three did not present any of the studied genes, four presented only one of the isolated genes (blaZ, femB and mecA), five simultaneously presented the mecA-blaZ genes, five only for the blaZ gene, and one the femB-blaZ genes. The results obtained demonstrate the presence of SCP and S. aureus only in the initial stages of production, important because it is an indicator of manipulation and hygiene within the production chain of pork. We also verified the presence of strains with multidrug resistance and heterorresistence to the different antimicrobians tested, as well as confirmation and MRSA strains within the isolates, besides the presence of Heterorresistencia among the isolates, showing the Importance of microbiological monitoring by phenotypic and molecular methodologies.
Resumo
Os estafilococos são frequentemente associados a surtos de intoxicações alimentares. Dentre os alimentos envolvidos nesses surtos encontram-se o leite e seus derivados, principalmente, queijos produzidos de forma artesanalmente e com leite cru. Este trabalho objetivou identificar os Staphylococcus coagulase positiva (CoPS), verificar o potencial enterotoxigênico através da pesquisa dos genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas (sea, seb, sec, sed e see), verificar a capacidade de produzir biofilme através do Ágar Vermelho Congo (CRA), identificar a ocorrência dos genes icaA, icaC e icaD, caracterizar fenotipicamente o perfil de resistência à antimicrobianos e detectar molecularmente a presença de genes resistência aos fármacos beta-lactâmicos (mecA e blaZ) e dos genes mecC e femA em cepas de Staphylococcus sp. Para este estudo foram testadas 58 isolados de Staphylococcus coagulase positiva e 46 isolados de Staphylococcus coagulase negativa (CoNS), totalizando 104 cepas bacterianas, isoladas do leite (33 isolados) e de seus respectivos queijos (71 isolados) artesanais serrano, produzidos na região serrana de Santa Catarina. A técnica de multiplex PCR foi utilizada para a pesquisa dos genes sea, seb, sec, sed, see, icaA, icaC, icaD, mecA, mecC, blaZ e femA. A produção fenotípica de biofilme foi realizada pelo cultivo bacteriano em Ágar Vermelho Congo (CRA). Das 58 cepas de CoPS analisadas 64% foram identificadas fenotípica e genotipicamente como S. aureus. Oito cepas CoPS isoladas do leite apresentaram o gene seb e uma cepa oriunda do queijo foi positiva para o gene sea. Nenhum gene para as SEs foi detectado nas cepas de CoNS. Quanto ao potencial em formar biofilme das cepas CoPS, 53% (31/58) foram positivas para o gene icaA isoladamente, 5% (3/58) apresentaram somente o gene icaD e 27% (16/58) apresentaram ambos os genes icaA e icaD. Em relação aos CoNS 100% das amostras foram positivas para o gene icaA e 9% (4/46) apresentaram, simultaneamente, os genes icaA e icaD. Quanto ao teste do CRA, 64% (67/104) cepas de Staphylococcus spp. foram positivas e destas 7% (5/67) não apresentaram nenhum dos genes icaA, icaD e icaC testados. Para a detecção do perfil de resistência 103 cepas foram submetidas ao teste de susceptibilidade a antimicrobianos, no qual observou-se maiores índices de resistência contra a PEN (41% CoPS) e (31% CoNS), AMO (40% CoPS), AMP (36% CoPS) e SUT (35% CoNS). Vinte e sete (26%) cepas (18 CoPS e 9 CoNS) demosntraram perfil de multirresistência, sendo resistentes a pelo menos três diferentes classes dos antimicrobianos testados. Observou-se ausência dos genes mecC em todas as cepas, 12 cepas (9 CoPS e 3 CoNS) foram positivas para mecA e 10 cepas (4 CoPS e CoNS) positivas para blaZ. A alta prevalência de Staphylococcus aureus, a presença de genes codificadores de enterotoxinas, genes formadores de biofilme e genes de resistência a antimicrobianos, bem como, a presença de cepas resistentes e multirresistentes evidenciam o potencial de virulência dos CoPS e CoNS, destacando a importância de serem seguidas rigorosamente as boas práticas de fabricação do alimento. Ademais, estes resultados destacam um risco para clínica veterinária e para a saúde pública, uma vez que, esses genes de resistência podem ser transferidos ao homem e/ou aos animais, dificultando ou até mesmo impossibilitando o tratamento de doenças potencialmente curáveis.
Staphylococi are often associated with outbreaks of food poisoning. Among the foods involved in these outbreaks are milk and its derivatives, mainly, cheeses produced by handmade and with raw milk. This work aimed to identify Coagulase positive Staphylococcus (CoPS), to verify the enterotoxigenic potential by investigating the genes coding for staphylococcal enterotoxins (sea, seb, sec, sed and see), verify the ability to produce biofilm through Congo Red Agar (CRA), to identify the occurrence of icaA, icaC and icaD genes, phenotypically characterize the antimicrobial resistance profile and molecularly detect the presence of resistance genes to beta-lactam drugs (mecA and blaZ) and the mecC and femA genes in strains of Staphylococcus spp. For this study, 58 strains of Staphylococcus coagulase positive and 46 strains of Staphylococcus coagulase negative (CoNS) were tested, totalizing 104 bacterial strains, isolated from milk (33 isolates) and their respective handmade serrano cheeses (71 isolates), produced in the mountain region of Santa Catarina Santa. The multiplex PCR technique was used for the search of the genes sea, seb, sec, sed, see, icaA, icaC, icaD, mecA, mecC, blaZ and femA. Phenotypic biofilm production was performed by bacterial culture in Congo Red Agar (CRA). Of the 58 CoPS strains analyzed, 64% were identified phenotypically and genotypically as S. aureus. Eight strains CoPS isolated from the milk showed the seb gene and one strain from the cheese was positive for the sea gene. No gene for SEs was detected in the strains of CoNS. As for the biofilm formation potential of the CoPS strains, 53% (31/58) were positive for the icaA gene alone, 5% (3/58) presented only the icaD gene and 27% (16/58) presented both icaA and icaD genes. In relation to the CoNS, 100% of the samples were positive for the icaA gene and 9% (4/46) presented the icaA and icaD genes simultaneously. Regarding the CRA test, 64% (67/104) strains of Staphylococcus spp. were positive and of these 7% (5/67) did not present any of the icaA, icaD and icaC genes tested. For the detection of the resistance profile, 103 strains were submitted to the antimicrobial susceptibility test, in which higher resistance indices were observed against PEN (41% CoPS) and (31% CoNS), AMO (40% CoPS), AMP (36% CoPS) e SUT (35% CoNS). Twenty-seven (26%) strains (18 CoPS and 9 CoNS) demonstrated a multiresistance profile and were resistant to at least three different classes of antimicrobials tested. Absence of mecC was observed in all strains, 12 strains (9 CoPS and 3 CoNS) were positive for mecA and 10 strains (4 CoPS and 6 CoNS) positive for blaZ. The high prevalence of Staphylococcus aureus, the presence of enterotoxin encoding genes, biofilm forming genes and antimicrobial resistance genes, as well as the presence of resistant and multiresistant strains show the potential for virulence of CoPS and CoNS, highlighting the importance of strict adherence to good food manufacturing practices. In addition, these results highlight a risk for veterinary clinics and public health, since these resistance genes can be transferred to humans or animals, making it difficult or even impossible to treat potentially curable diseases.
Resumo
A mastite é causada por inúmeros agentes etiológicos. O Staphylococcus aureus é considerado um dos micro-organismos que mais provocam a enfermidade. O mesmo também causa sérias infecções purulentas tanto no homem, quanto nos animais, tornando-se um agente zoonótico de relevância para Saúde Pública. O presente trabalho teve por objetivo a identificação de Staphylococcus aureus Meticilina Resistente (MRSA), através de sua caracterização e classificação molecular e fenotípica, em diferentes amostras provenientes de propriedades da região de Cascavel PR. Para tanto, foi realizada uma triagem com amostras colhidas de tanque de expansão de 69 propriedades. Estas amostras foram submetidas à pesquisa dos genes de resistência mecA e blaZ e do gene femA para confirmação da espécie, utilizando a Reação em Cadeia pela Polimerase. Dentre o total de positivos na PCR, quatro propriedades que apresentaram os genes de resistência, foram visitadas novamente. Todas as vacas em lactação dessas propriedades foram submetidas ao teste de CMT para verificar a presença de mastite subclínica. Em seguida foram realizadas colheitas de amostras de tanque, teteiras, amostras de leite de animais com mastite subclínica e clínica e suabe de fossas nasais e das mãos dos manipuladores, que foram analisadas fenotipicamente (Gram, oxidase, catalase, coagulase, manitol e Dnase), genotipicamente (genes femA, coag, blaZ e mecA) e testadas para a sensibilidade a antimicrobianos. As amostras positivas para S. aureus foram submetidas à técnica de Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) para tipificar os isolados. Foi aplicado um questionário epidemiológico com o objetivo de conhecer os fatores de risco relacionados com a presença dos genes de resistência. Como resultados, observamos a presença de 42 isolados tipificados pela técnica PFGE, com amostras positivas para os genes testados (24,21% para mecA; 84,37% para blaZ; 100% para coag e femA) e teste de sensibilidade a antimicrobianos (presença de resistência a Oxacilina) caracterizando MRSA. No PFGE observamos uma heterogeneidade quanta à presença de pulso tipos dentro das propriedades, e até mesmo a presença de um mesmo pulso tipo em propriedades diferentes e locais diferentes, demonstrando a diversidade clonal existente e a provável circulação dos micro-organismos. No presente estudo não foram encontrados fatores de risco quando analisados pelo programa software Epi infoTM 7.
Mastitis is caused by numerous etiological agents. Staphylococcus aureus is considered one of the micro-organisms that most cause the disease. The same also causes serious purulent infections in both humans and animals, becoming a zoonotic agent of relevance to Public Health. The present work aimed at the identification of Resistant Methicillin Staphylococcus aureus (MRSA), through its characterization and molecular and phenotypic classification, in different samples from properties of the Cascavel - PR region. In order to do so, a sample was collected with samples collected from the 69 properties expansion tank. These samples were submitted to the search of the mecA and blaZ resistance genes and the femA gene for confirmation of the species using Polymerase Chain Reaction. Among the total of positives in the PCR, four properties that presented resistance genes, were visited again. All lactating cows of these properties were submitted to the CMT test to verify the presence of subclinical mastitis. After that, samples of milk, milk samples from animals with clinical and subclinical mastitis and nasal fossa were collected, and phenotypically analyzed (Gram, oxidase, catalase, coagulase, mannitol and Dnase) , Genotyped (femA, coag, blaZ and mecA genes) and tested for antimicrobial susceptibility. Samples positive for S. aureus were submitted to pulsed field gel electrophoresis (PFGE) technique to typify the isolates. An epidemiological questionnaire was applied in order to know the risk factors related to the presence of resistance genes. As results, we observed the presence of 42 PFGE-typed isolates, with positive samples for the genes tested (24.21% for mecA, 84.37% for blaZ, 100% for coag and femA) and antimicrobial susceptibility test Presence of resistance to oxacillin) characterizing MRSA. In PFGE we observed a quantum heterogeneity to the presence of pulse types within the properties, and even the presence of a same pulse type at different properties and different sites, demonstrating the existing clonal diversity and the likely circulation of the microorganisms. In the present study, no risk factors were found when analyzed by the software program Epi infoTM 7.
Resumo
A mastite representa um grande desafio na pecuária leiteira, visto que é uma das afecções que mais acometem o rebanho bovino ocasionando grande impacto econômico. As bactérias são importantes agentes associados à enfermidade, sendo que as mais comumente encontradas são as do gênero Staphylococcus, associadas tanto às manifestações clínicas quanto subclínicas. A terapia antimicrobiana é usualmente requerida como tratamento, auxiliando as defesas do animal para a eliminação do agente invasor, sendo assim, de suma importância monitorar a sensibilidade dos patógenos aos antimicrobianos. Visto que a resistência aos medicamentos utilizados tem se tornado frequente, há a necessidade de estudos mais abrangentes sobre o assunto. Desta forma, o presente estudo avaliou 300 isolados de Staphylococcus provenientes de amostras de leite de bovinos com mastite clínica e/ou subclínica de propriedades de exploração leiteira. A espécie mais detectada nas análises foi S. aureus, e dentre os genes que codificam para adesinas e biofilmes os mais frequentes foram (eno, fib e fnbA) e (bap, icaA, icaD). A combinação mais frequente no tocante às adesinas foi eno-fib-fnbA, e para os biofilmes foram bap e bap-icaD. Os maiores índices de resistência foram verificados para os antimicrobianos betalactâmicos (amoxicilina, ampicilina e penicilina). Identificou-se as maiores frequências de sensibilidade para cefalotina, seguida pela oxacilina e gentamicina, e não foi detectada relação de concordância da oxacilina com os betalactâmicos. Avaliou-se a concentração mínima inibitória (MIC) para ampicilina, gentamicina, oxacilina e penicilina, para todas as cepas resistentes no antibiograma. Posteriormente, investigou-se os genes responsáveis pela codificação de resistência antimicrobiana, com os genes femA e femB sendo os mais comuns, porém o gene femA não foi detectado em todas as cepas de S. aureus. Os genes mecA e blaZ foram identificados, porém em baixa frequência, e o homólogo de mecA, o mecALGA251, somente em duas cepas. As informações obtidas podem ajudar em diferentes aspectos acerca dos perfis dos microrganismos no tocante aos fatores de virulência dos mesmos, permitindo novas abordagens relativas a terapias e medidas de prevenção à mastite.
Mastitis represents a major challenge in dairy farming, since it is one of the affections that most impact the cattle herd, causing great economic distress. Bacteria are important agents associated with the disease, and the most commonly found are those of the genus Staphylococcus, associated with both clinical and subclinical manifestations. Antimicrobial therapy is usually required as a treatment, assisting the animal's defenses to eliminate the invading agent, and it is therefore of paramount importance to monitor the susceptibility of pathogens to antimicrobials. Since resistance to drugs commonly used has become frequent, there is a need for more comprehensive studies on the subject. Thus, the present study evaluated 300 isolates of Staphylococcus from samples of dairy cattle from dairy farms. The most prevalent species in the analyses were S. aureus, and among the genes coding for adhesins and biofilms the most frequent combinations were (eno, fib and fnbA) and (bap, icaA, icaD). The most frequent combination for adhesins was eno-fib-fnbA, and for biofilms they were bap and bap-icaD. The highest resistance indices were verified for betalactam antibiotics (amoxicillin, ampicillin and penicillin). The highest frequencies of sensitivity were identified for cephalothin, followed by oxacillin and gentamicin, and no concordance relationship was found between oxacillin and betalactam. Minimum inhibitory concentration (MIC) for ampicillin, gentamicin, oxacillin and penicillin were performed for all strains resistant to the antibiogram. Subsequently, the genes responsible for the encoding of antimicrobial resistance were investigated, with the femA and femB genes being the most common, but the femA gene was not detected in all strains of S. aureus. The mecA and blaZ genes were identified, but at low frequency, and the mecA homolog, mecALGA251, was only found in two strains. The information obtained can help in different aspects about the microorganisms' profiles regarding their virulence factors, allowing new approaches to therapies and mastitis prevention measures.
Resumo
This work aimed at isolating Staphylococcus spp. from minas frescal type cheese, and for this purpose a Multiplex PCR (M-PCR) was standardized for detecting the classical Staphylococcus aureus enterotoxingenes (sea, seb, sec, sed and see), using the femA gene as a positive control for S. aureus strains. Bacterial detection directly from the minas frescal type cheese and from artificially contaminated food was tested.One hundred eleven colonies (104 coagulase-positive and seven coagulase-negative) were selected for performing M-PCR assay. Thirty-four colonies (30.62%) were positive for at least one of the fiveente rotoxin genes analyzed; enterotoxins sea and seb were the most frequently detected. The study on Staphylococci coagulase-positive samples revealed that 40% of the samples showed bacterial counts above the limit established by Brazilian legislation. (AU)
Assuntos
Staphylococcus/isolamento & purificação , Queijo , Enterotoxinas , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
A cadeia produtiva de carne suína está susceptível a diferentes fontes de contaminação microbiológica em diferentes etapas, desde a produção primária até o processamento de produtos finais. Considerando o contexto atual de comércio internacional de produtos, o controle de eventuais perigos microbiológicos deve ser efetivo, visando a inocuidade dos produtos finais e segurança do consumidor. Em relação a carne suína, Staphylococcus coagulase positiva (SCP) possui grande importância por serem importantes indicadores das condições de manipulação, e também por indicarem a presença de S. aureus, que na cadeia produtiva de suínos possui relevância pela possibilidade de carrear genes de resistência a diferentes antimicrobianos nos produtos finais e consumidores. O objetivo desse estudo foi rastrear a contaminação por SCP e S. aureus resistentes a antimicrobianos na cadeia produtiva de carne suína. Duas granjas de criação de suínos (ciclo completo) e um frigorífico foram selecionados para coleta de 603 amostras ao longo da cadeia produtiva de carne suína (1 - Granjas: baia de terminação, n = 18; 2 - Abate: carcaça após sangria, n = 90; carcaça após chamuscamento, n = 90; carcaça após evisceração, n = 90; carcaça após lavagem, n = 90; 3 - Processamento: faca limpa, n = 27; faca durante processamento, n = 27; mãos limpas, n = 27; mãos durante processamento, n = 27; mesa limpa, n = 27; mesa durante processamento, n = 27; 4 - Produtos finais: costela, n = 18; paleta, n = 18; pernil, n = 18; linguiça, n = 9), que foram submetidas a enumeração de SCP, e posterior isolamento e identificação de S. aureus. A contaminação por SCP foi inferior a 2 log UFC/cm² ou g em 512 (84,9%) amostras, entre 2 e 3 logs UFC/cm² ou g em 52 (8,6%) amostras, entre 3 e 4 logs UFC/cm² ou g em 6 (1,0%) amostras, e superior a 4 log UFC/cm² ou g em 33 (5,5%) amostras. Contagens superiores a 4 log UFC/cm² ou g foram observadas em baias de terminação, carcaças após evisceração, carcaças após lavagem, facas limpas, mesas limpas, costela e linguiças. A enumeração de SCP foi possível em 197 (32,7%) amostras, e as contagens médias variaram entre 1,0 log UFC/cm² (mesa durante processamento) e 5,2 logs UFC/cm² (baia de terminação). Considerando as diferentes etapas de processamento, não foram observadas diferenças significativas entre as amostras obtidas no ambiente de processamento e nos produtos finais (p > 0,05). Durante o abate, as contagens médias de SCP obtidas nas carcaças após sangria foram superiores quando comparadas as etapas posteriores (p > 0,05). Um total de 315 colônias de SCP foi selecionado e caracterizado quanto ao perfil bioquímico e presença do gene femA para identificação de S. aureus. Assim, 246 isolados de S. aureus foram identificados e submetidos a caracterização de seus perfis de resistência em relação a 11 antimicrobianos, por testes de susceptibilidade e pela pesquisa de genes relacionados a resistência. Considerando os resultados fenotípicos, 90,7% dos isolados de S. aureus apresentaram resistência a sulfamethoxazole (SUL), 87,0% a ciprofloxacina (CIP), 67,9% a penicilina (PEN), 49,6% a eritromicina (ERI), 40,2% a oxacilina (OXA), 40,2% a clindamicina (CLI), 29,3% a rifampicina (RIF), 28,5% a cloranfenicol (CLO), 21,1% a tetraciclina (TET), 16,3% a vancomicina (VAN) e 6,5% a gentamicina (GEN). Apenas 15 isolados foram susceptíveis a todos os antimicrobianos testados (isolados obtidos de baias de terminação, carcaças, pernil e linguiça), 7 a apenas um antimicrobiano (CIP, SUL ou TET), e os demais resistentes simultaneamente a 2 a 10 diferentes antimicrobianos; o perfil de resistência a PEN-ERI-CIP-SUL foi o que apresentou maior frequência entre os isolados de S. aureus (n = 37). Em relação aos genes relacionados a resistência a diferentes antimicrobianos, 74,0% dos isolados de S. aureus apresentaram resultados positivos para blaZ (PEN), 8,1% para femB (OXA), e 3,7% para tetK (TET); não foram observados resultados positivos para vanA (VAN), mecA e mecC (OXA). Entre os isolados de S. aureus, 60 não apresentaram nenhum dos genes pesquisados, 164 apresentaram apenas um dos genes isolados (blaZ, femB e tetK), 15 apresentaram simultaneamente os genes femB-blaZ, 4 os genes blaZ-tetK, e 3 os genes femB-blaZ-tetK. Apenas em relação a TET foi verificado que o teste de susceptibilidade foi equivalente a presença de blaZ (p = 0,147), e ausência de equivalência de resultados para OXA (femA, femB), VAN (vanA) e TET (tetK) (p < 0,05). Os resultados obtidos demonstram a relevância de SCP como indicadores de manipulação e higiene na cadeia produtiva de carne suína, assim como a presença de S. aureus com resistência a diferentes antimicrobianos, alertando para a necessidade de monitoramento por metodologias fenotípicas e moleculares.
The pork production chain is susceptible to different sources of microbiological contamination at different stages, from primary production to the processing of final product. Regarding the current context of international trade in products, the control of possible microbiological hazards must be effective, aiming at the safety of final products and consumer. In relation to pork, Staphylococcus coagulase positive (SCP) is relevant because they are important indicators of the manipulation condition and also because they indicate the presence of S. aureus, which in the production chain of pigs has relevance due to the possibility of carrying resistance genes to different antimicrobials in the final products and consumers. The objective of this study was to track the contamination by SCP and S. aureus resistant to antimicrobial in the pork production chain. Two pig farms (complete cycle) and a refrigerator were selected to collect 603 samples through the pork production chain (1 - Farms: termination bay, n = 18; 2 - Slaughter: carcass after bleeding, n = 90; carcass after scorching, n = 90; carcass after evisceration, n = 90; carcass after washing, n = 90; 3 - Processing: clean knife, n = 27; knife during processing, n = 27; clean hands, n = 27; hands during processing, n = 27; clean table, n = 27; table during processing, n = 27; 4 - Final products: rib, n = 18; palette, n = 18; leg, n = 18; sausage, n = 9) which were submitted to SCP enumeration, subsequent isolation and identification of S. aureus. The SCP contamination was less than 2 log CFU / cm² or g in 512 (84.9%) samples, between 2 and 3 log CFU / cm² or g in 52 (8.6%) samples, between 3 and 4 CFU logs / cm² or g in 6 (1.0%) samples, and greater than 4 log CFU / cm² or g in 33 (5.5%) samples. Counts greater than 4 log CFU / cm² or g were observed in termination bins, carcasses after evisceration, carcasses after washing, clean knives, clean tables, rib and sausages. SCP enumeration was possible in 197 (32.7%) samples, and the mean counts varied between 1.0 log CFU / cm² (table during processing) and 5.2 log CFU / cm² (termination bay). Considering the different steps of the process, no significant differences were observed between the obtained samples in the processing environment and in the final products (p> 0.05). During slaughter, the SCP mean counts obtained on carcasses after bleeding were higher when compared to the later stages (p> 0.05). A total of 315 SCP colonies were selected and characterized in relation to the biochemical profile and the presence of the femA gene for identification of S. aureus. Thus, 246 isolates of S. aureus were identified and submitted to characterization of their resistance profiles in relation to 11 antimicrobials, by susceptibility tests and by the search of genes related to resistance. Taking into account the phenotypic results, 90.7% of S. aureus isolates showed resistance to sulfamethoxazole (SUL), 87.0% to ciprofloxacin (CIP), 67.9% to penicillin (PEN), 49.6% to erythromycin (IRI), 40.2% to oxacillin (OXA), 40.2% to clindamycin (CLI), 29.3% to rifampicin (RIF), 28.5% to chloramphenicol (CLO), 21.1% to tetracycline (TET), 16.3% vancomycin (VAN) and 6.5% gentamycin (GEN). Only 15 isolates were susceptible to all antimicrobials tested (isolates obtained from finishing bays, carcasses, shanks and sausage), 7 to only one antimicrobial (CIP, SUL or TET), and the other resistent simultaneously to 2 to 10 different antimicrobials; the resistance profile to PEN-ERI-CIP-SUL was the most frequent among S. aureus isolates (n = 37). Regarding the genes related to resistance to different antimicrobials, 74.0% of S. aureus isolates presented positive results for blaZ (PEN), 8.1% for femB (OXA), and 3.7% for tetK (TET); no positive results were observed for vanA (VAN), mecA and mecC (OXA). Among the S. aureus isolates, 60 did not present any of the studied genes, 164 had only one of the isolated genes (blaZ, femB and tetK), 15 simultaneously presented the femBblaZ genes, 4 the blaZ-tetK genes, and 3 femB-blaZ-tetK genes. Only in relation to TET, the susceptibility test was equivalent to the presence of blaZ (p = 0.147), and no equivalence of results for OXA (femA, femB), VAN (vanA) and TET (tetK) (p < 0.05). The results obtained demonstrate the relevance of SCP as indicators of handling and hygiene in the pork production chain, as well as the presence of S. aureus with resistance to different antimicrobials, highlighting the need for monitoring by phenotypic and molecular methodologies.
Resumo
This work was performed to detect the Staphylococcus aureus gene, enterotoxins resistance to methicillin with the extraction of DNA directly from milk samples. Of the 200 samples studied 145 (72.5%) amplified the femA gene, which were analyzed regarding the presence of sea, seb, sec and mecA genes. The most prevalent enterotoxins genes were: sea (60%), seb (37.9%) and sec (6.9%). 18 milk samples (11 %) had S. aureus carrying the mecA gene. The detection of S. aureus directly from the milk, with no need for bacterial isolation and the characterization of the enterotoxigenic potential demonstrate that the PCR technique is very useful for epidemiological studies of staphylococcal infections of the mammary gland. The high percentage (72.5%) of positive milk samples for the presence of the femA gene suggests that S. aureus constitutes of the main agents which cause intramammary infections in the micro region of Sete Lagoas-MG and that its enterotoxigenic potential and the presence of the mecA gene, which identifies the S. aureus resistant to methicillin, represent a potential risk to public health.
Realizou-se a detecção do gene de Staphylococcus aureus, de enterotoxinas e de resistência à meticilina com extração de DNA feita diretamente de amostras de leite. Das 200 amostras estudadas, 145 (72,5%) amplificaram o gene femA, e estas foram analisadas quanto à presença dos genes sea, seb, sec e mecA. Os genes das enterotoxinas mais prevalentes foram: sea (60%), seb (37,9%) e sec (6,9%). Foram encontradas 18 amostras de leite (11,0 %) com S. aureus portadores do gene mecA. A detecção de S. aureus diretamente do leite, sem a necessidade de isolamento bacteriano e a caracterização do potencial enterotoxigênico, demonstra que a técnica de PCR é muito útil para estudos epidemiológicos das infecções estafilocócicas da glândula mamária. O alto percentual (72,5%) de amostras de leite positivas para a presença do gene femA sugere que S. aureus constitui um dos principais agentes causadores de infecções intramamárias na microrregião de Sete Lagoas-MG e que seu potencial enterotoxigênico e presença do gene mecA, que identifica o S. aureus resistente à meticlina, representa um risco potencial à saúde pública.
Resumo
Esta tese é composta por três artigos, que estão divididos em capítulos. No primeiro capítulo foi abordado as condições gerais e adequações quanto às Boas Práticas de Fabricação (BPF) de oito queijarias artesanais de queijo de coalho, com o principal objetivo de investigar as conformidades e não conformidades relativas a sua implementação. Para tanto, usou-se como critério avaliativo um cheklist baseado na Resolução RDC nº 275 da ANVISA/MS, onde os resultados mostraram que das oito queijarias, apenas uma classificou-se como de baixo risco, ou seja, com mais de 76% de adequações. As principais não conformidades foram: instalações, controle de pragas e da água, higiene dos manipuladores, ausência de tratamento térmico da matéria prima e documentação. O segundo capítulo relata os principais pontos de contaminação do queijo de coalho em queijarias artesanais do Sertão paraibano, avaliando a qualidade higiênica do processamento através da quantificação de coliformes, mesófilos, Escherichia coli e identificação de Staphylococcus spp. Em amostras de leite, queijos, swabs do tanque de fabricação, mesa, fôrma e mãos dos manipuladores, além da água utilizada na fabricação e limpeza dos equipamentos, onde os resultados demonstraram que o leite cru de todas as queijarias apresentaram alta contaminação microbiológica, estando em desacordo com a IN 62 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. A superfície da mesa, tanque, fôrma e mãos dos manipuladores também apresentaram altas contagens para todos os micro-organismos. No queijo detectou-se coliformes a 30º C, termotolerantes e E. coli. As contagens de Staphylococcus spp. apresentaram acima de 1,3 x 105UFC/g, podendo favorecer a produção de enterotoxinas sob condições adequadas e os principais agentes isolados nas amostras foram S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis. O leite apresentou S. aureus em todas as queijarias, porem, no queijo houve predomínio de espécies coagulase negativa, sendo também encontradas nos utensílios e mãos dos manipuladores. O terceiro capítulo aborda a identificação dos genes FemA, Coa com sequenciamento das amostras positivas para esse gene e de enterotoxinas clássicas nas 51 cepas de Staphylococcus spp isoladas a partir de amostras de leite, queijo de coalho e utensílios obtidas em três queijarias artesanais. De acordo com a identificação das espécies, das 51 cepas obtidas, 16 foram identificadas como S. aureus, porém, todas as amostras de Staphylococcus spp. foram submetidas a técnica de PCR para presença do gene femA e coa, onde houve amplificação do gene femA em 40 amostras e apenas 20 amostras, cujos tamanhos variaram de aproximadamente 500 a 900 pb. Na pesquisa das enterotoxinas, nenhum dos isolados analisados possuía os genes sec e see. Houve apenas a amplificação para o gene sea e seb em uma mesma amostra e sed em outra. As amostras positivas para o gene Coa foram submetidas ao Blast e exibiram grande homologia com sequencias codificadoras do gene da estafilocoagulase de S. aureus depositadas no NCBI. Foi construída uma árvore filogenética baseada nas sequencias, onde foi apresentada a relação entre as amostras. As cepas oriundas do leite, queijo, mãos dos manipuladores da queijaria A apresentaram bastante similaridade, sugerindo que o leite cru e as mãos contribuíram para a contaminação do queijo. O mesmo ocorreu com as amostras das mãos e tanque da queijaria C. Este estudo mostrou que a identificação genotípica de Staphylococcus spp. pode ser feita pela amplificação do gene femA e do gene Coa, com apresentação de grande polimorfismo genético. A identificação do gene para enterotoxinas mostrou-se útil para avaliar um possível perfil dos S. aureus e o sequenciamento confirmou os pontos de contaminação bacteriana no processamento de fabricação do queijo de coalho.
This thesis is composed by three articles which are divided into chapters. On the first chapter, it was discussed the general conditions and adequacies regarding the Good Manufacturing Practices (GMP) of eight artisanal curdled cheese factories and which the main objective was to investigate the conformities and non-conformities related to its implementation. Therefore, it was used, as evaluation criteria, a checklist based on the resolution RDC number 275 of ANVISA/MS, and the results showed that from the eight evaluated cheese factories, only one was classified as low risk, that is with more than 76% of adequacies. The main non-conformities were: facilities, water and plague control, handlers hygiene, lack of thermal treatment of raw material and documents. The second chapter reports the main contamination spots of curdled cheese in artisanal cheese factories in the sertão of Paraíba, evaluating the hygienic quality of processing through the quantification of coliforms, mesophilic, Escherichia coli and identification of Staphylococcus spp. In milk samples, cheese, swabs from the fabrication tank, table, mold and handlers hands, and also on water used in the fabrication and cleaning of the equipment, the results showed that the raw milk from all the cheese factories was highly contaminated with microorganisms, therefore being in discordance with the Normative Instruction (IN) 62 of the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply. The surface of the table, mold and handlers hands also showed high rate of all microorganisms. On the cheese, it was detected thermotolerant coliforms at 30º C as well as E. coli. The counts for Staphylococcus spp. showed more than 1,3 x 105UFC/g, which favors the production of enterotoxins under adequate conditions and the main isolated agents on the samples were S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis. The milk indicated S. aureus in all cheese factories. However, on the cheese there was a predominance of coagulase-negative specimens, which were also found in utensils and handlers hands. The third chapter discusses the identification of FemA, Coa genes, with sequencing of positive samples for this gene as well as the classical enterotoxins on the 51 strains of Staphylococcus spp isolated from milk samples, curdled cheese and utensils from three artisanal cheese factories. According to the identification of the specimens, of the 51 obtained strains, 16 were identified as S. aureus. However, all Staphylococcus spp. samples were submitted to PCR technique to detect the presence of femA and coa gene, where there was amplification of the femA gene in 40 samples and only in 20 samples the size varied from approximately 500 to 900 pb. In the research of the enterotoxins, none of the analyzed which were isolated had the sec and see genes. There was only the amplification for the sea and seb gene on the same sample and for the sed gene in another. The samples which were positive for the Coa gene were submitted to Blast and showed great equivalence with coding sequences of the Staphylococci coagulase of S. aureus stored in NCBI. A phylogenetic tree was built based on the sequences which presented relation with samples. The strains originated from milk, cheese, handlers hands showed great similarity, suggesting that the raw milk and the hands contributed for the cheese contamination. The same situation occurred with the samples from hands and from tank of cheese factory C. This study showed that the genotypic identification of Staphylococcus spp. can be done by the amplification of femA and Coa genes, with abundant genetic polymorphism. The identification of the gene for enterotoxins resulted to be useful to evaluate a possible S. aureus profile and the sequencing confirmed the bacterial contamination spots in the processing of curdled cheese fabrication.
Resumo
Realizou-se a detecção do gene de Staphylococcus aureus, de enterotoxinas e de resistência à meticilina com extração de DNA feita diretamente de amostras de leite. Das 200 amostras estudadas, 145 (72,5%) amplificaram o gene femA, e estas foram analisadas quanto à presença dos genes sea, seb, sec e mecA. Os genes das enterotoxinas mais prevalentes foram: sea (60%), seb (37,9%) e sec (6,9%). Foram encontradas 18 amostras de leite (11,0 %) com S. aureus portadores do gene mecA. A detecção de S. aureus diretamente do leite, sem a necessidade de isolamento bacteriano e a caracterização do potencial enterotoxigênico, demonstra que a técnica de PCR é muito útil para estudos epidemiológicos das infecções estafilocócicas da glândula mamária. O alto percentual (72,5%) de amostras de leite positivas para a presença do gene femA sugere que S. aureus constitui um dos principais agentes causadores de infecções intramamárias na microrregião de Sete Lagoas-MG e que seu potencial enterotoxigênico e presença do gene mecA, que identifica o S. aureus resistente à meticlina, representa um risco potencial à saúde pública.
This work was performed to detect the Staphylococcus aureus gene, enterotoxins resistance to methicillin with the extraction of DNA directly from milk samples. Of the 200 samples studied 145 (72.5%) amplified the femA gene, which were analyzed regarding the presence of sea, seb, sec and mecA genes. The most prevalent enterotoxins genes were: sea (60%), seb (37.9%) and sec (6.9%). 18 milk samples (11 %) had S. aureus carrying the mecA gene. The detection of S. aureus directly from the milk, with no need for bacterial isolation and the characterization of the enterotoxigenic potential demonstrate that the PCR technique is very useful for epidemiological studies of staphylococcal infections of the mammary gland. The high percentage (72.5%) of positive milk samples for the presence of the femA gene suggests that S. aureus constitutes of the main agents which cause intramammary infections in the micro region of Sete Lagoas-MG and that its enterotoxigenic potential and the presence of the mecA gene, which identifies the S. aureus resistant to methicillin, represent a potential risk to public health.
Assuntos
Resistência a Meticilina , Leite/microbiologia , Enterotoxinas , Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
A água é essencial para o desempenho do animal e pode interferir em vários processos de produção, tais como a saúde animal. Antimicrobianos são amplamente utilizados na produção animal e podem ser uma ameaça para a saúde humana e animal. Com isso, a pesquisa para detectar os genes de resistência a antibióticos (ARGs) em ambientes aquáticos é importante para identificar potenciais reservatórios microrganismos resistentes A metagenômica baseia-se na análise de moléculas de DNA genômico a partir de populações microbianas de amostras ambientais, e tem sido proposta por ser a técnica mais acurada para descrever as comunidades microbianas presentes em um habitat. Estudos em amostras de água de lagos de zoológicos e de consumo animal de água são escassos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a presença de genes de resistência aos antimicrobianos, qualidade da água de lagos de zoológico e de granjas de suínos e a diversidade bacteriana em águas de granjas de suínos. As amostras de água de oito fazendas de suínos e nove lagos de zoológico foram coletadas. Estas foram filtradas pelo sistema de bomba a vácuo e o DNA extraído dos filtros. A PCR foi realizada para seis classes de gene de resistência aos antimicrobianos: sulfonamidas (sul I e sul II), -lactâmicos (ampC, blaPSE I e blaZ), macrólideos (ermA, ermB e ermC), meticilinas (mecA, femA e msrA), aminoglicosídeos [aac(6')-aph(2"), aph3'-III e ant(4')-Ia] e tetraciclinas [tet (K) e tet (M)]. DNA extraído a partir de amostras de água de sete granjas de suínos foram sequenciados e a análise metagenômica realizada utilizando o servidor MG-RAST. Todas as amostras apresentaram genes de resistência a pelo menos três das classes do antimicrobianos dos seis testados. Isto indica um perfil de resistência a múltiplas drogas na água que pode estar relacionado com o uso indiscriminado de antibióticos. Os genes sul I, sul II, blaPSE I, ermB e blaZ foram detectadas em todas as amostras Os aminoglicosídeos [aac(6')-aph(2"), aph3'-III e ant(4')-Ia] foram detectados em 87,5% de amostras; e ermA, femA e ampC em 75%. Não houve evidência entre a presença de genes de resistência, análise microbiológica e físico-química; ou entre análise microbiológica (total e coliformes fecais) e a quantidade de genes de resistência. A água do zoológico também apresentou o perfil de multirresistência e turbidez, devido à presença de contaminantes. Os genes mais frequentes foram sulfonamidas (sul I e sul II) que estão presentes em todos os lagos e -lactâmicos blaPSE I em 77,8% e ampC em 66,7%. O genes tet(K), tet(M) e ermC não foram detectados. Houve a correlação entre o número de enterobactérias e aumento na detecção do gene de resistência. As águas das granjas apresentaram uma diversidade bacteriana distribuídos em doze filos, e o mais frequente foram: Bactérias não-classificadas, Proteobacterias e Firmicutes. O filo Bactérias não-classificadas, mais abundante, pode estar relacionada com a influência das actividades humanas ou por causa da técnica 16S rDNA ser sensível para as espécies de baixa frequência e restrito a espécies conhecidas. As águas das granjas estão dentro do aceitável para o consumo animal. No entanto, a presença de genes de resistência antimicrobiana é alta, o que pode ter conexão direta com irrigação usando águas residuais das lagoas de decantação, associados com o uso indiscriminado de antibióticos. A provável fonte de contaminação dos lagos do zoológico são esgoto doméstico ou águas residuais urbanas provenientes residências vizinhas que aumentam a presença de coliformes e frequência de genes de resistência, que pode ser um risco para a vida dos animais selvagens em cativeiro. Foi relatada uma diversidade bacteriana das amostras e os resultados inesperados foram detectados, como a abundância de Bactérias não-Classificadas, que podem estar relacionadas pela ação antropogênica ou pela técnica que está limitada a espécies conhecidas.
Water is essential for animal performance and can interfere in various production processes, such as animal health. Antimicrobials are widely used in animal production and can be a threat to human and animal health. With that, research to detect the antibiotic resistance genes (ARGs) in aquatic environments is important to identify potential reservoirs resistant microorganisms The metagenomic assay is based on the genomic DNA molecules analysis from microbial populations in environmental samples, and has been proposed to be the most accurate technique to describe microbial communities present in a habitat. These studies in animal consumption waters samples or zoos lakes are scarce. Therefore, the objective of this study was to evaluate the presence of resistance genes to antimicrobiaals, pigs farm and zoo lakes water quality and bacterial diversity in pigs farms waters. Water samples from eight pig farms and nine Zoo lakes were collected. These were filtered by vacuum pump system and DNA extracted from the filters. The PCR was done for the resistance gene six classes of antimicrobial: sulfonamides (sul I and sul II), -lactam (ampC, blaPSE I and blaZ), macrolides (ermA, ermB and ermC), meticilinas (mecA, femA and msrA), aminoglycosides (aac (6')-aph (2"), aph3-III and ant(4)-Ia) and tetracyclines [tet(K) and tet(M)]. DNA extracted from seven pigs farm water samples were sequenced and metagenomic analyzes conducted using MG-RAST server. All samples showed resistance genes at least three of the six antimicrobials classes tested. This indicates a profile of multidrug resistance in the water that may be related with the indiscriminate use of antibiotics. The genes sul I, sul II, blaPSE I, ermB and blaZ were detected in all samples. The aminoglycosides (aac (6')-aph (2"), aph3-III and ant(4)-Ia) were detected in 87.5% samples; and ermA, femA and ampC in 75%. There was no evidence between presence of resistance genes, microbiological and physicochemical evaluation; or between microbiological analysis (total and fecal coliforms) and amount of resistance genes. The zoo water also presented the multiresistance profile and turbidity due to the presence of contaminants. The most common genes were sulfonamides (sul I and sul II) which are present in all lakes and -lactamics blaPSE I in 77,8% and ampC in 66,7%. The tet(K), tet(M) and ermC were not detected. There was the correlation between the number of Enterobacteriaceae and increased in resistance genes detection. DNAs water extracted from seven farms were sequenced and it was made metagenomic analysis by MG-RAST server. The farms water showing a bacterial diversity distributed in twelve phyla with the most common being Unclassified from bacteria, Proteobacteria and Firmicutes. The phylum Unclassified from bacteria, more abundant, can be related to influences of human activities or because of 16S rDNA technique is sensitive to low-frequency species and restricted to known species. The waters farms are within the acceptable for animal consumption. However, the antimicrobial resistance genes presence is high, which may have direct connection with irrigation using wastewater from the settling lagoons, associated with the indiscriminate use of antibiotics. The likely sources zoo Lakes contamination are urban sewage or wastewater from neighboring residences that increase the presence of coliforms and frequency of resistance genes, which can be a risk to life of wild animals in captivity. It was reported a bacterial diversity in the samples and unexpected results were detected, as the abundance of Unclassified from bacteria, that may be related by the anthropogenic action or by the technique is restricted to known species.
Resumo
O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus (n=100) isoladas de mastite em rebanhos bovinos do Estado de Minas Gerais. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR empregando oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente para amplificar genes específicos de S. aureus (femA), S. intermedius (rDNA 16S) e S. hyicus (rDNA 16S-23S) e o sequenciamento do rDNA 16S. De acordo com as reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados. Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus e os 17 restantes. Os seis isolados identificados como S. aureus confirmaram essa identificação. Dos outros 17 isolados, 13 foram identificados como S. chromogenes e quatro como S. hyicus, com similaridade igual ou superior a 99%. Baseando-se nos resultados da reação de PCR do gene femA e do sequenciamento do rDNA 16S, foram identificados 83 S. aureus, 13 S. chromogenes e quatro S. hyicus. Neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chromogenes; e os empregados na reação de PCR para S. hyicus não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus. A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.(AU)
The objective of this study was to identify the species of 100 isolates of Staphylococcus from mastitis in dairy cows from herds located in the state of Minas Gerais, Brazil. PCR reactions were carried out using specific primers described previously for S. aureus (femA gene), S. intermedius (16S rDNA) and S. hyicus (16S-23S rDNA spacer region). In addition, products of amplification of variable regions of the 16S rDNA gene of the strains were sequenced. According to the results of the PCR, 83 strains were identified as S. aureus, 13 as S. intermedius, two as S. hyicus and two isolates were not identified. The sequencing of 16S rDNA was applied to 23 strains identified by PCR amplifications: six S. aureus and the strains identified as S. intermedius (n=13), S. hyicus (n=2) or not identified (n=2). The sequencing of 16S rDNA confirmed the six strains as S. aureus. The others 17 strains were identified as S. chromogenes (13 isolates) and S. hyicus (four isolates). Each sample was related to a specie according to the smallest E-value and highest similarity (≥ 99%). The identification of S. hyicus and S. chromogenes was accomplished only by 16S rDNA sequencing.(AU)
Assuntos
Animais , Mastite Bovina/patologia , Staphylococcus/patogenicidade , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Infecções/microbiologiaResumo
Staphylococcus aureus é um dos mais importantes patógenos em medicina veterinária e o crescente surgimento de cepas resistentes a diversas classes de antimicrobianos eleva a necessidade de uma correta identificação e monitoramento desta espécie bacteriana. Este trabalho objetivou inicialmente avaliar a acuracia da PCR para os marcadores dos genes nuc, femA e coa na identificação de S. aureus obtidos de amostras de diferentes espécies animais. Foram analisados um total de 71 isolados de Staphylococcus spp. através do MALDI-TOF e foram identificadas 12 espécies de Staphylococcus diferentes. Dos Staphylococcus aureus (34) os genes femA, nuc e coa foram identificados em 30, 26 e 16 dos isolados, respectivamente. Embora a especificidade da PCR para todos os marcadores testados tenha sido de 100%, a sensibilidade encontrada foi de 88,2, 76,5 e 46,5 para os marcadores femA, nuc e coa, respectivamente. A sensibilidade foi de 100% quando utilizado os marcadores femA e nuc simultaneamente. Os resultados confirmam a PCR como uma técnica precisa para identificação de S. aureus e sugere o uso simultâneo dos primers femA e nuc. Posteriormente objetivou-se avaliar os perfis de resistência antimicrobiana e a relação genotípica entre S. aureus isolados a partir de fossas nasais de equinos sadios oriundos de dois Estados geograficamente distantes do Brasil (Paraíba e Rio Grande do Sul). De uma total de 123 Staphylococcus spp. analisados inicialmente, 21 isolados foram identificados como Staphylococcus aureus por testes bioquimicos e PCR utilizando-se marcadores espécie-específicos (nuc, femA e coa). Os resultados demonstraram quatro perfis de resistência diferentes. Foi observada multirresistencia em 10 isolados de S. aureus. Embora nenhum isolado tenha sido encontrado carreando o gene mecA, seis isolados resistentes a meticilina foram encontrados, indicando a presença de Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA). A genotipagem por Rep-PCR demonstraram que os isolados não foram agrupados por sua origem geográfica, e indicam uma elevada diversidade de cepas de Staphylococcus aureus colonizando cavalos sadios no Brasil.
Staphylococcus aureus is a major pathogen in veterinary medicine and the increasing emergence of strains resistant to different classes of antimicrobial agents elevates the need for accurate identification and monitoring of this bacterial species. This study aimed to initially evaluate the accuracy of PCR for nuc, femA and coa genes for identification of S. aureus obtained from different animal species samples. A total of 71 Staphylococcus spp. isolates were analyzed through the MALDI-TOF and were identified 12 different species. Among Staphylococcus aureus (34) the femA, nuc and coa genes were identified in 30, 26 and 16 isolates respectively. Although the specificity of the PCR for all markers tested was 100%, the sensitivity was found 88.2%, 76.5% and 46.5% for femA, nuc and coa markers, respectively. The sensitivity was 100% when used the femA and nuc markers simultaneously. The results confirm the PCR technique as a accurate for S. aureus identification and suggests the simultaneous use of femA and nuc primers. Later aimed to evaluate the antimicrobial resistance patterns and genotypic relationship between S. aureus cultured from nasal cavities of healthy horses from two geographically distant states of Brazil (Paraíba and Rio Grande do Sul). A total of 123 Staphylococcus spp. analyzed initially, 21 isolates were identified as Staphylococcus aureus by biochemical tests and PCR using species-specific markers (nuc, femA and coa). The results showed four different resistance patterns. Multidrug resistance was observed in 10 S. aureus isolates. Although none S. aureus has been found harboring mecA gene, 6 methicillin-resistant isolates were found, indicating the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Genotyping by Rep-PCR showed that the isolates were not grouped by geographical origin, and indicate an enormous diversity of Staphylococcus aureus strains colonizing healthy horses in Brazil.
Resumo
Evaluation of a simplified key for the identification of coagulase-positiveStaphylococcus isolated from bovine mastitis. Three hundred fourty four strains of coagulasepositiveStaphylococcus (CPS), isolated from mastitis cases, underwent phenotypic and genotypictests to evaluate the efficiency of a simplified key, based on phenotypic tests for thediscrimination of these microorganisms. The tests consisted of amplification of the femA geneand hemolysis in blood agar, production of acetoin and fermentation of maltose, mannitol andtrehalose. Strains that showed negative results in the amplification test of the femA gene or thatwere not identified as Staphylococcus aureus (S. aureus) by phenotypic tests were tested with theAPISTAPH kit (Biomériux-France), for precise identification of species. Phenotypic testsrevealed 338 strains (98.25%) as S. aureus, three strains (0.86%) as Staphylococcus hyicus, and threemicroorganisms (0.86%) as Staphylococcus intermedius. PCR demonstrated that 338 (98.25%)strains belonged to the S. aureus species, confirming the results for 336 strains from 338identified, through a simplified phenotypic key. A high rate of correlation (98.83%) was verifeidbetween the results of genotypic and phenotypic tests for the identification of S. aureus,demonstrating the applicability of the proposed key, for the discrimination of this microorganismin CPS isolated from bovine mastitis.(AU)
Visando testar a eficiência de uma chavesimplificada baseada em testes fenotípicos para a discriminação de Staphylocococcus coagulasepositivos (SCP) isolados de infecções intramamárias de bovinos, 344 amostras destesmicrorganismos foram submetidas a testes fenotípicos e genotípicos. Estes consistiram naamplificação do gene femA, na observação de hemólise em ágar sangue, produção de acetoína efermentação de maltose, manitol e trealose. Amostras que apresentaram resultado negativo naamplificação do gene femA ou que foram identificadas com não Staphylococcus aureus (S. aureus) pormeio dos testes fenotípicos foram submetidas ao kit APISTAPH (Biomériux-França) paraidentificação mais precisa. Os testes fenotípicos utilizados na chave simplificada permitiramidentificar 338 amostras (98,25%) como S. aureus, três amostras (0,86%) como Staphylococcus hyicuse três (0,86%) como Staphylococcus intermedius. Por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR)338 (98,25%) amostras foram identificadas como S. aureus, ratificando os resultados para 336 das338 amostras identificadas por meio da chave fenotípica simplificada. Observou-se elevadaconcordância (98,83%) entre os resultados dos testes genotípicos e fenotípicos para a identificaçãode S. aureus, demonstrando a aplicabilidade da chave de identificação proposta para adiscriminação deste microrganismo entre SCP isolados de casos de mastite bovina.(AU)
Assuntos
Animais , Mastite , Mastite Bovina , Staphylococcus , Coagulase , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
Objetivou-se investigar a prevalência, o perfil de resistência antimicrobiana e a relação genotípica entre Staphylococcus aureus (S. aureus) isolados de suínos em diferentes fases de criação. Com base no cálculo do tamanho amostral, foram colhidos swabs nasais de 282 animais de três diferentes granjas no Nordeste, localizadas nos municípios de Areia e Santa Rita (Paraíba) e Itapetim (Pernambuco). Considerando a emergente importância em saúde pública dos Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), foi realizado protocolo paralelo para isolamento desses microrganismos em todas as amostras. Após isolamento microbiológico convencional e realização de testes fenotípicos e genotípicos para identificação do gênero Staphylococcus, foi realizada PCR para identificação de marcadores moleculares específicos de S. aureus. Dentre as amostras analisadas, 48,9% (138/282) foram positivas para Staphylococcus spp., dentre as quais 15,94% (22/138) foram positivas para Staphylococcus aureus. A prevalência de S. aureus na Granja 1 foi de 2,07% (IC=0,71;5,91) e na Granja 3 de 2,97% (IC=1,91;4,59). Não foi isolado S. aureusdos animais da granja 2. Dentre os marcadores para a espécie S. aureus, o gene femA foi o mais frequentemente encontrado. Resistência a pelo menos um antimicrobiano foi detectada em todos os S. aureus investigados, sendo as maiores taxas de resistência observadas para clindamicina (100%), ampicilina (100%) e penicilina (100%), seguidos de clorafenicol (95,45) e azitromicina (90,91%). De todos os S. aureus, 63,64% (14/22)apresentaram resistência à cefoxitina, confirmando serem resistentes à meticilina (MRSA).A análise de similaridade genética por Rep-PCR indicou o agrupamento das bactérias em função de sua origem. Além disso, isolados de diferentes setores de produção apresentaram-se indistinguíveis, indicando que cepas de S. aureus podem infectar animais em diferentes fases de criação.
Aimed to investigate the prevalence, the pattern of antimicrobial susceptibility and the genotypic ratio of Staphylococcus aureus (S. aureus) isolated from pigs in differents age groups. Based of calculation of sample size, were collected 282 nasal swabs of pigs from three differents farms in Northest, located in the citys of Areia and Santa Rita (Paraiba State) and Itapetim (Pernambuco State). Considering the emerging public health significance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), parallel protocol was performed to isolate these microorganism in all samples. After conventional microbiological isolation and conducting tests for phenotypic and genotypic identification of Staphilococcus genus, PCR was conducted to identify molecular markers specific of S. aureus. Among the samples analyzed, 48.9% (138/282) were positive for Staphylococcus spp., among with 15.94% (22/138) were positive for S. aureus. The prevalence of S. aureus in the Farm 1 was 2.07% (CI = 0.71, 5.91) and Farm 3 was 2.97% (CI = 1.91, 4.59). It was not isolated S. aureus from the animals of Farm 2. Among the markers for the S. aureus species, femA gene was the most frequently found. Resistance to at least one antimicrobial agent was detected in all investigated S. aureus, with the higthest rates observed to clindamycin (100%), ampicillin (100%) and penicillin (100%), followed by chloraphenicol (95.45%) and azithromycin (90.91). Of all S. aureus, 63.64% (14/22) were resistant to cefoxitin, confirming be resistant to methicillin (MRSA). The genetic similarity analysis by Rep-PCR indicated the grouping of bacteria due to its origin. Also, isolates from different sectors of production have become indistinguishable, indicating that S. aureus strains can infect pigs at different age groups.